[发明专利]溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段及其制备方法和应用

权利要求书

1.溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段，其特征在于，所述的多肽片段为溶组织内阿米巴150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端的多肽片段，150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No：1所示；所述的150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）从培养的溶组织内阿米巴滋养体中提取总RNA，通过RT-PCR合成cDNA；

（2）合成引物：

EH150-S749-XHO：5’- CCCTCGAGACTGAACAAAGGCTAAAAGA-3’

EH150-AS1088-XHO：5’-CCCTCGAGTTAAATGCCTTTAGCTCCATT-3‘   ；

（3）以cDNA为模板，通过PCR获得150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因片段；

（4）将编码基因克隆入原核表达载体中，转化宿主菌，培养所得重组工程菌，然后诱导其表达目的蛋白；

（5）采用缓冲液对150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的包涵体进行洗涤，将其提纯后，采用谷胱甘肽还原系统对其复性，获得重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所分离的总RNA来源于溶组织内阿米巴滋养体。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中， 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因如SEQ ID No：1所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中， 150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端编码基因，其所编码的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA基因重组，形成适宜表达质粒。

7.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体。

8.根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pET19b。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。

10.根据权利要求2或8所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 Star? (DE3)pLysS。

11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养宿主细胞的培养基是LB液体培养基，培养温度是20～37℃，培养时间3～16小时。

12.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，菌体达到合适的浓度后用IPTG诱导表达，诱导条件为：IPTG浓度为0.1～1mM，诱导温度为20～37℃，诱导时间为2～16小时。

13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段的最终产物通过下述方法纯化：将150kDa的Gal/GalNAc可抑制性凝集素的C末端多肽片段表达工程菌在37℃诱导3小时后，离心收集菌体，置于冰上超声裂解，然后加入溶菌酶30℃振摇30分钟，离心，收集包涵体蛋白沉淀，以Novagen公司的refolding kit 对包涵体蛋白进行提纯与复性后，14000rmp离心20分钟，收集上清，冰箱保存。

14.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制备与阿米巴病患者血清反应制剂中的用途。

15.权利要求1的溶组织内阿米巴半乳糖/乙酰氨基半乳糖多肽片段在制备溶组织内阿米巴粗抗原的血清诊断制剂中的用途。