[发明专利]一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物技术领域中血液制品的纯化方法，确切地说是一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法。

二、背景技术

凝血因子IX(Coagulation factor IX，简写为FIX)和凝血因子X(Coagulation factor X，简写为FX)都是维生素K依赖因子，它们都是由肝细胞合成并分泌到血液中，并在凝血反应中发挥各自的活性[1]。FIX和FX都是糖蛋白，人源FIX的分子量为57,000，含多糖17％左右[2]；人源FX的分子量为72,000，含多糖10％左右[3]。

FIX和FX在凝血的瀑布反应中，位于内外源通路的交汇点，所以对凝血过程有着非常重要的作用。FIX在血浆中的的含量一股认为有5毫克/升左右，而FX在血浆中的的含量为10毫克/升左右。

FIX是一个非常重要的药物，在临床上被用作治疗B型血友病。B型血友病(也称作Christmas病)是一种非常严重的疾病。B型血友病患者的血液在体内和体外凝血活性降低，而他们的一生都必须在严格的医疗监控下度过。这些患者必须补充外源的正常血浆中提取的FIX，才可以让凝血时间恢复正常，且目前没有其他任何替代品。

FX虽然没有作为药物在临床使用，但是FX是个使用范围广泛的科研试剂。FX作为凝血通道上的重要环节，是一个很好的抗凝血药物的设计靶标。同时，FX也是一个选择性很高的精氨酸肽键水解酶，可以被设计成融合基因表达的融合蛋白的限制性内切酶。

因此，从血浆中高效率纯化制备FIX和FX具有重要的现实意义。

自上个世纪七十年代，FIX、FX第一次被纯化[4，5]发展到今天，国内外现在已经有多种从血液中纯化天然FIX、FX的方法。单纯的多步离子交换层析，或是离子交换层析和亲和层析相结合的方法，是当前普遍认可的从血液中提取高纯度FIX和FX的有效方法。多步离子交换层析，步骤繁琐，需要耗费较长的时间[6，7]。FIX、FX都是酶原，在长时间的纯化处理过程中，它们会被活化成活化状态的FIX(FIXa)、活化状态的FX(FXa)，所以，使用多步离子交换层析很难得到纯度较高的未被活化的FIX、FX。FIXa和FXa是具有生物学活性的水解酶，如果是临床用FIX中含有部分FIXa，则有可能在体内触发凝血反应形成血栓；FX虽然大部分情况是作为实验试剂被使用，但对纯度的要求也是很高的。离子交换层析和亲和层析相结合的方法较单纯的多步离子交换层析步骤简化，可以很大程度上解决多步离子交换层析费时的问题，且亲和配基对FIX或FX的特异性结合更有利于获得高纯度的FIX或FX[8]。目前已有的技术中，亲和效果最好的配基为Ca²⁺依赖型的单克隆抗体，其结合-解离条件简单温和，在含有Ca²⁺的缓冲溶液中抗体可以和抗原特异性结合，将淋洗液换成含有EDTA的缓冲溶液即可以洗脱下抗原。但是，单克隆抗体造价昂贵，且稳定性较差，难以大量应用到工业大批量生产。肝素是另一种亲和配基，它是一种带负电荷的多聚物，是AT-III的辅因子，又是许多凝血因子的抑制剂，可以通过静电和亲和相互作用可分离血浆中的很多凝血因子。肝素价格较便宜，但是亲和的特异性很差。

申请人长期从事蛇毒中FIX/FX结合蛋白家族的研究，徐小龙教授在2000年从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中纯化了两种FIX/FX结合蛋白(FIX/FX-bp)，分别命名为ACF I和ACF II[9]。此后不仅对ACF I、ACF II进行了深入的研究[10，11]，同时也对不同蛇毒来源的FIX/FX-bp都进行了深入的研究，如江浙蝮蛇的中的FIX/FX-bp AHP[12]，竹叶青中的FIX/FX-bp等等。蛇毒中FIX/FX-bp属于C型凝集素类似蛋白家族，所研究的几个FIX/FX-bp，分子量均为30kD左右，都有α和β两条多肽链，都是α链和β链通过二硫键连接。FIX/FX-bp大多具有两个金属离子的结合位点，其在天然状态下就结合两个金属离子，例如，AHP在天然状态下结合一个Ca²⁺，一个Zn²⁺[12]。FIX/FX-bp在Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺等离子存在的条件下既可以结合FIX，也可以结合FX，在这些金属离子不存在的条件下，会迅速和已经结合的FIX或FX发生解离[13]。FIX/FX-bp与IX、X都有很高的结合活性，且其特异性仅限于FIX和FX。FIX/FX-bp作为爬行动物的外分泌蛋白，具有很好的稳定性，且廉价易得。