[发明专利]胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种干细胞差异膜蛋白的检测方法，特别涉及胎盘和脐带来源的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCSs）表面差异膜蛋白的检测方法。

背景技术

干细胞(stem cells,SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞(MSCSs)是干细胞家族的重要成员，最早来源于骨髓，因其具有强大的增殖能力和多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控等特点使其在组织工程、细胞治疗和基因治疗等方面具有广泛的临床应用前景。近年来，随着人们对间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，已成功地从骨髓、外周血、肌肉、脂肪、脐血、脐带及胎盘等组织中分离并鉴定出MSCSs。其中，胎盘来源MSCSs易分离培养，增殖迅速，可以分化为3个胚层来源的细胞系，并有向伤处迁移的能力；同时胎盘在临床上为废弃物，取材几乎不受限制，且不涉及伦理问题；因此是很好的实验材料和细胞治疗载体。而脐带来源的间充质干细胞，迄今的研究表明，它不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能，它表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，因此也极具具临床应用前景。因此，本发明选择这两种细胞作为被检测对象。

骨髓来源的MSCS能够表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、基质细胞抗原l(Stro．1)、干细胞抗原1(Sca.1)、CXC类趋化因子受体4(CXCR-4)和CXCR.6等表面标志，但是不表达造血细胞表面标志：CD1 lb、CD14、CD31、CD33、CD34、CD133 和CD45。胎盘来源的MSCS表达CD29、CD44和CD105，不表达CD34、CD45、CD19。脐带来源的MSCS表达CD13、CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45。但胎盘和脐带MSCS表面标志，不同文献报到不尽相同。换而言之，骨髓、胎盘和脐带MSCS都没有明确的细胞表面标志。脐带作为连接胎儿和胎盘的管状结构，其分离出的MSCS和胎盘MSCS表面表达的差异有何不同，目前还没有资料标明，但这种差异在发育生物学上有着重要意义，本专利就是采用一种新的技术手段，来揭示胎盘和脐带中分离出的MSCS表面蛋白表达差异。

发明内容

    本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，该方法可用于检测胎盘、脐带两种不同来源的间充质干细胞表面的特殊的膜蛋白标志。

双向凝胶电泳是蛋白质组研究中的主流技术，但该技术的重复性和敏感性不佳，且缺乏对蛋白质点的精确定量，近年来出现的双向荧光差异显示凝胶技术(two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)克服了传统的双向凝胶电泳技术的上述缺点，2D-DIGE在传统双向凝胶电泳技术的基础上，结合多重荧光分析的方法，在同一块胶上分离多个由不同荧光标记的样品，并第一次引入了内标的概念，软件自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准，保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的，极大地提高了结果的准确性，可靠性和重复性，避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性。

因此我们我们通过双向荧光差异凝胶电泳对不同来源的膜蛋白进行分析，来研究胎盘和脐带MSCS表面差异蛋白，在此基础上一方面可制备单抗，进行MSCS的鉴定，另一方面，揭示两者在发育生物学上的关系。

为解决技术问题，本发明是通过如下的技术方案实现的：

提供一种胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，包括以下步骤：

（1）间充质干细胞的分离和培养

如间充质干细胞为胎盘来源，则：取新鲜胎盘组织剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，使用Ficoll分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，洗两遍，收集细胞，常规培养；

如间充质干细胞为脐带来源，则：取新鲜脐带组织，剥离血管，剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，离心，收集细胞，常规培养；

所有间充质干细胞均培养至对数生长期，用于移植；

（2）间充质干细胞膜蛋白的提取

反复冻融法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的组分；

（3）双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱