[发明专利]一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)，具体涉及一种明胶酶A抑制性多肽(M205C4)的修饰物及其制备方法。明胶酶A抑制性多肽的修饰物，简称为M205C4-PEG。

背景技术

局部侵袭和远处转移是恶性肿瘤的主要生物学特征，也是导致肿瘤患者较高死亡率的主要原因。目前的研究认为在肿瘤的侵袭、转移过程中，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的破坏是关键环节。在参与破坏细胞外基质的酶类中基质金属蛋白酶类(matrix metalloproteinases，MMPs)是最重要的蛋白水解酶，尤其是MMP2、MMP9在癌细胞侵袭转移过程中不仅可以酶解细胞间基质成分，还能酶解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原。所以设计寻找针对MMPs拮抗药物就尤为重要。目前已有人工合成的MMPs抑制物，如：Marimastat、Batimastat、Mtastat、BAY12-9566、AG-3340、CGS-27023A和SC-204092等，正在进行不同阶段临床试验。虽然这类小分子化合物可以有效抑制基质金属蛋白酶的酶解作用，但同时所产生的细胞毒作用会给试用者带来强烈的副作用。由此研究人员把目光转向了基质金属蛋白酶类的组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases , TIMPs）家族。TIMPs的主要功能是天然地抑制MMPs的活性，在调节细胞外基质的代谢中起到了重要作用。其中TIMP-1被认为是组织中MMPs活性主要调节者，控制着大多数的MMPs家族成员。然而TIMPs对肿瘤却是把双刃剑，一方面，通过对抗MMPs蛋白的水解作用抑制肿瘤的浸润。但肿瘤也需要对抗自身的过度水解，所以TIMPs对肿瘤生长同样是必须的。另外，还对肿瘤细胞增殖、凋亡、血管形成等方面起到了关键作用，因此对肿瘤的发展具有双向性。因此寻找结合了小分子化合物和TIMPs蛋白优势的新型药物是我们的研究重点。

多肽类药物具备高效、低毒和特异性强的显著性优势。M205C4是通过噬菌体展示技术筛选的特异性MMP2抑制性结合肽，拮抗作用模拟了TIMPs对MMPs活性调节的方式，可以有效的抑制肿瘤细胞的侵袭转移并于2006年成功报批国家专利（ZL200610085779.7）。经后期实验证明，M205C4对多种肿瘤细胞的生长及血管新生没有明显的促进作用，符合我们的新药筛选标准。但同时也存在肽类药物在体不稳定、易降解的问题，无法使药物在体发挥其特有的生物学活性。而对于药物的修饰同时要考虑到其自身空间结构改变所导致的活性变化和体内代谢行为两个重要因素以外，修饰的工艺化问题也是不容忽视的。所以修饰及其制备方法的选择对于药物的后期研究至关重要。

发明内容

发明目的：针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种M205C4的修饰物，修饰后药物保留了原有生物学活性的同时，降低了免疫原性，延长了其在生物体内的半衰期。本发明的另一个目的是提供一种M205C4的修饰物的制备方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种明胶酶A抑制性多肽的修饰物，为mPEG-sc对多肽M205C4组氨酸氨基端的单点修饰产物，结构式为

，

分子量为11000~13000；结构式中，为mPEG的结构式，HNWTRWLLHPDRGGGS为多肽M205C4的氨基酸序列。

一种制备明胶酶A抑制性多肽的修饰物的方法，包括以下步骤：

（1）按摩尔比为1:1~5分别称取M205C4和mPEG-SC，定溶于pH5.0-8.0的PBS缓冲液中，M205C4的反应浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应3h以上，制得M205C4-PEG混合液；

（2）采用SunfireTM C18 OBDTM 制备色谱柱（Waters 2545-2767-UV2489制备液相系统）对步骤（1）制得的M205C4-PEG混合液进行液相分离和浓缩，制得浓缩液；对浓缩液进质谱检测，将浓缩液分装至2ml EP管中，在液氮中过夜保存；检测：纯度在90%以上，分子量为11000~13000；

（3）将过夜保存在液氮的制备样品放入冻干仪中浓缩至冻干粉末，即可。

步骤（1）中，优选：按摩尔比约为1:3分别称取M205C4和mPEG -SC，定溶于pH7.4的PBS缓冲液中，M205C4的浓度为100 uM；在静音混合器上，4℃反应3h。

上述的明胶酶A抑制性多肽的修饰物在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。