[发明专利]一种在丝状噬菌体上高密度表达目的多肽的方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及多肽表达，具体涉及一种将多肽表达在丝状噬菌体的方法及其应用。

技术背景

噬菌体展示技术( phage display) 是一种基因表达筛选技术, 通过将目的基因插入噬菌体衣壳蛋白的基因中, 使外源基因产物与衣壳蛋白融合, 伸展在噬菌体表面, 并从表达的外源蛋白的噬菌体群体( 库)中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体, 以直接检测表达产物的某些活性。丝状噬菌体是一种丝状病毒颗粒, 长880nm, 直径6～7 nm，其基因组为6.4 kb 单链环状DNA, 编码10 种不同蛋白质。其主要衣壳蛋白( gp8)有2700 个左右拷贝, 围绕DNA 呈螺旋对称管状排列,覆盖于噬菌体的体部。gp8 蛋白的N 端游离在外, 外源肽通过柔性接头与其N 端连接, 这一结构对于在主要外壳蛋白表面展示外源多肽具有特殊意义。通过分子生物学方法，将目的多肽的基因导入至噬菌体的主要衣壳蛋白gp8基因上，可以获得融合表达有目的多肽的噬菌体。由于主要衣壳蛋白gp8的拷贝数量有2700-3000个，因此可得到高密度的表达的多肽，目前，在丝状噬菌体病毒表达的高密度多肽可主要用于以下三个方面：

1、有毒有害化学物质模拟表位肽的表达及其在免疫学检测方法中的应用研究

当前，大量有毒有害化学物质如黄曲霉毒素 B₁、赭曲霉毒素 A、玉米赤霉烯酮等对人体健康和环境造成了严重危害，以酶联免疫吸附分析方法为代表的免疫学检测方法具有较高的灵敏度和特异性，对样品的纯度要求不高，且操作简单，特别适合于大批量样本的检测，已被广泛应用黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等有毒有害物质的快速检测。

大多数有毒有害物质属小分子物质，没有供二株不同抗体结合的表位，必须采用竞争免疫分析方法进行检测。因此，需要制备用于竞争免疫分析的竞争抗原。常规制备竞争抗原用化学方法将这些有毒有害物质与载体偶联，该方法存在以下弊病：①试剂本身含有毒有害物质，若操作不慎，会对生产和操作人员的健康造成极大的危害，并可导致二次污染等环保隐患。②大多数标准品依赖进口，部份标准品难以获得且价格昂贵，使检测试剂的成本居高不下。③偶联反应的重复性差，部份标准品不稳定，致使检测产品的质量难以控制。

由此，科学家们设想用有毒有害物质的替代品参与免疫竞争反应，建立无毒的免疫学检测方法。新兴的噬菌体随机肽库展示技术可高效挑选出能与靶分子相结合的噬菌体，并利用这些噬菌体再感染大肠杆菌进行扩增，即可获得能模拟该靶分子表位的肽（模拟表位肽）。将这些有毒有害物质的模拟表位肽的基因导入至噬菌体的主要衣壳蛋白gp8基因上，可得到表达在丝状噬菌体表面的高密度模拟表位；噬菌体在保存条件下相当稳定，易于扩增，吸附力强，可做成固相竞争抗原，从而达到替代有毒有害物质竞争抗原，建立无毒免疫检测方法及产品的目的。

2、难以获得或传染性强的病毒的抗原表位肽的表达及其在免疫学检测方法中的应用

在临床上，通常对乙肝病毒、丙肝病毒和艾滋病病毒等的诊断需要检测患者血液中相应抗体，就必须使用这些病毒的相关抗原，而这些病毒一般是具有较强传染性或难以在体外培养的病毒，因此这些病毒的抗原难以通过常规手段获得。有不少通过基因工程的方法，将这些病毒的抗原进行大规模制备。噬菌体随机肽库展示技术也为这些抗原的制备提供了新的切入点。将这些病毒的抗原表位肽的基因导入至噬菌体的主要衣壳蛋白gp8基因上，可得到表达在丝状噬菌体表面的高密度抗原表位；噬菌体在保存条件下相当稳定，易于扩增，吸附力强，可做成检测抗原，用于这些病毒的抗体检测，从而达到替代病毒抗原，建立无病毒免疫检测方法及产品的目的。

3、高密度抗原表位肽在制作亚单位疫苗的应用

用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗称为抗原表位疫苗，包括合成肽疫苗和重组抗原表位亚单位疫苗。本发明涉及的是重组亚单位疫苗。合成肽与载体分子连接后可诱导很好的免疫应答，但很少能在接种动物中产生长期保护性免疫反应。而重组抗原表位亚单位疫苗采用DNA重组的方式，外源抗原表位可插入载体分子上，并可在真核或原核系统中进行复制和表达。迄今人们已经发展了许多这样的具有颗粒样结构的外源抗原表位表达载体系统，如HBV核心抗原(HBcAg)和HBsAg载体系统，在重组杆状病毒中表达的HIV- 1 gag蛋白载体系统、轮状病毒(RV)Vp6蛋白载体系统、蓝舌病毒核心颗粒载体系统，以及丝状的和二十面体的噬菌体载体系统等。利用丝状噬菌体系统表达的亚单位苗具有培养条件简单，成本低、噬菌体易于提纯和保存等优点，是一种很有应用潜力的亚单位疫苗表达系统。