[发明专利]一种检测和鉴别蚊媒体内疟原虫子孢子的方法

权利要求书

1.一种检测和鉴别蚊媒体内疟原虫子孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)设计一对引物，为

18S-qF：5’-ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3’

18S-qR：5’ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3’；

2)提取媒介按蚊体内疟原虫子孢子基因组DNA；

3)通过荧光定量PCR反应对蚊媒体内疟原虫基因组DNA进行扩增；

4)将扩增产物熔解后得到熔解曲线，并与阳性对照和阴性对照进行比对。

2.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤2)的DNA提取方法包括以下步骤：

a)将蚊媒体头胸部置于1.5ml离心管中；

b)加50μl 1×PBS于步骤a)所述的离心管中，用玻璃研磨棒研磨5-10min，再加入100μl Buffer ATL；

c)加20μl蛋白酶K于步骤b)所述的离心管中，56℃，摇动3小时；

d)加200μl Buffer Al于步骤c)所述的离心管中，振动15s，70℃放置10分钟；

e)加200μl无水乙醇于步骤d)所述的离心管中，振动15s，得到混合液；

f)将步骤e)所述的处理后的混合液置于QIAamp离心纯化柱中离心，8000rpm，1分钟，将纯化柱去除过滤液后置于一回收管中；

g)在上述步骤f)处理后的纯化柱中加入500μl Buffer AW1，并离心，8000rpm，1分钟，将纯化柱去除过滤液后置于另一回收管中；

h)在上述步骤g)处理后的纯化柱中加入500μl Buffer AW2，并离心，14000rpm，3分钟，将柱子去除过滤液后置于再一回收管中，继续离心，14000rpm，1分钟；

i)将上述步骤h)处理后的纯化柱去除过滤液后置于离心管中，加入30μl BufferAE，室温静置5分钟，再离心，8000rpm，1分钟；

j)将上述步骤i)处理后的柱子中加入30ul双蒸水，室温静置5分钟，8000rpm，离心1分钟，得到模板DNA并于-20℃保存。

3.如权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)的荧光定量PCR反应体系包括有15ul 2×荧光定量PCR预混液；1.2ul浓度为5uM的引物18S-qF，1.2ul浓度为5uM的引物18S-qR，1μl上述步骤j)得到的模板DNA和11.6ul双蒸水。

4.如权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤3)的荧光定量PCR反应过程为95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火加延伸1min，共持续45个循环。

5.如权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4)的阳性对照为含有4种疟原虫目的片段的质粒DNA标准品，阴性对照为阴性按蚊DNA，阴性按蚊提取方法如权利要求2所述。

6.一种如权利要求5所述的鉴定方法在蚊媒体内疟原虫子孢子定量检测中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

A)构建分别含有4种疟原虫目的片段的质粒DNA标准品，质粒中所含目的片段序列分别为：恶性疟原虫标准质粒如序列1所示，间日疟原虫标准质粒如序列2所示，三日疟原虫标准质粒如序列3所示，卵形疟原虫标准质粒如序列4所示；

B)依步骤A)所述的质粒DNA标准品序列建立蚊媒体内疟原虫子孢子DNA定量曲线；

C)以步骤B)建立的定量曲线为标准曲线进行定量检测。