[发明专利]一种从动物肌肉中分离磷脂酶A2的方法

说明书

技术领域

本发明属于农产品加工技术领域，涉及一种从动物肌肉中分离磷脂酶A₂的方法。

背景技术

磷脂酶A₂具有多种生物学功能，如脂质代谢、信号传导以及消除炎症等，其还与肌肉毒素、神经毒素和心脏毒素等有关，因此磷脂酶A₂的分离纯化及其性质研究是医学领域的热点之一。同时因为磷脂酶A₂能够催化水解甘油磷脂Sn-2位酯键生成溶血磷脂（溶血磷脂的润湿能力、乳化稳定性等性能优于普通磷脂），所以磷脂酶A₂在多个产业领域（如食品、医药等）也有广泛应用。

目前，国内外研究人员对蛇毒、蜂毒、猪胰和微生物中的磷脂酶A₂开展了大量的研究，其中对蛇毒中磷脂酶A₂的克隆、表达与晶体结构模拟等都已有详细报道，另外对蜂毒磷脂酶A₂的DNA重组及结构也进行了研究，但这些酶基本都属于低分子量分泌型酶，并且对动物源磷脂（如蛋黄卵磷脂）水解的效率普遍较低。

到目前为止，可的提取磷脂酶A₂量较少，不能满足对高分子量细胞浆质型磷脂酶A₂纯品的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种可大量获取磷脂酶A₂的从动物肌肉中分离磷脂酶A₂的方法。

本发明方法步骤是：

1）取动物瘦肉组织剁碎后加入Tris-HCl缓冲液中匀浆，形成浆液；

2）在4℃的环境温度下，将浆液离心，取上清液，然后在上清液中加入70%饱和度的硫酸铵进行盐析，然后再在4℃的环境温度下离心，将沉淀物用Tris-HCl缓冲液溶解，取得混合溶液；

3）将混合溶液置于透析袋中，在Tris-HCl缓冲液中进行去盐透析，取得去盐的透析物；

4）将去盐的透析物在4℃的环境温度下离心去除变性蛋白，取得磷脂酶A₂粗品；

5）用蛋白纯化系统纯化磷脂酶A₂粗品，得磷脂酶A₂纯品；

其特征在于：所述步骤5）中，蛋白纯化系统为：采用source 15Q、15×5.5 cm的离子交换柱，用pH为8.0、浓度为50mmol/L、流速为0.1mL/min 的Tris-HCl缓冲液平衡，待紫外吸收和电导基线稳定后，再用pH为8.0、含1mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液进行线性洗脱，控制NaCl的Tris-HCl缓冲液进入离子交换柱的流速为1.5mL/min，开始收集滤出液，当滤出液的NaCl浓度达到100%停止收集；将收集的滤出液进行超滤浓缩，取得磷脂酶A₂纯品。

本发明采用从动物肌肉或加工后废弃的瘦肉中提取高分子量细胞浆质型磷脂酶A₂纯品，首先进行粗酶提取，然后使用离子交换柱对磷脂酶A₂进行纯化。本发明可以满足对高分子量细胞浆质型磷脂酶A₂纯品的需要，同时对动物源磷脂（如蛋黄卵磷脂）的水解效率也比较高，从而弥补了目前常用磷脂酶A₂产品的不足。因此本发明在医药、食品、生化等领域具有广泛的应用前景。

本发明采用离子交换法从动物肌肉中分离磷脂酶A₂，其优点在于：

（1）能够获得高分子量细胞浆质型磷脂酶A₂纯品，普通的磷脂酶A₂分子量为12-18KD，而本方法所得的磷脂酶A₂分子量为201KD，可以满足科研和生产中对该类磷脂酶A₂的需要。

（2）分离方法快速简洁，蛋白纯化只需经过离子交换柱即可完成。

（3）对蛋黄磷脂的水解效率高30.5%。以蛋黄卵磷脂为底物，25℃，普通磷脂酶A₂的活力为97.6μmol底物/h·g蛋白，而本方法所得的磷脂酶A₂的活力为127.37μmol底物/h·g蛋白。

附图说明

图1为磷脂酶A₂纯化的离子色谱图。

图2 为本发明所得磷脂酶A₂的活性电泳图。

图3 为本发明所得磷脂酶A₂的酶解产物的薄层层析图。

图4为本发明所得磷脂酶A₂的酶解产物的气相色谱图。

具体实施方式