[发明专利]一种含HSYA和IQBA的红花的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一种含两种有效成分羟基红花黄色素A和4-{11’-羟基-11’-巯基-11’-{1’-[2’-(N→O)-异喹啉基]}-1-苯甲酸的红花的筛选方法。

背景技术

红花Carthmus tmctorius L.为菊科植物红花的干燥管状花，临床应用广泛。主要化学成分有黄酮类、吲哚类、木脂素类、烷基二醇类等。其中羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，简称HSYA)是红花的重要活性成分，具有抗心肌缺血、脑缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等多种药理作用，对心脑血管疾病有很好的防治作用，具有很好的应用前景(吴伟，李金荣，朴永哲，董宁宁，金鸣.羟基红花黄色素A缓解大鼠心肌线粒体损伤的作用研究.中国药学杂志，2006，41(16)：1225-1227；金鸣，高子淳，王继峰.羟基红花黄色素A抑制PAF诱发的家兔血小板活化的研究.北京中医药大学学报，2004，27(5)：32；金呜，李金荣，吴伟.羟基红花黄色素A抗氧化作用的研究.中草药，2004，35(6)：665；施峰，刘焱文，红花的化学成分及药理研究进展，时珍国医国药，2006，17(9)：1666-1667)；4-{11’-羟基-11’-巯基-11’-{1’-[2’-(N→O)-异喹啉基]}-1-苯甲酸(简称IQBA)是本发明人从中药红花中研究获得的又一个具有脑缺血保护作用的化合物(Ge Zhang，Mei-Li Guo，Run-Ping Li，Ying Li，Han-Ming Zhang，Zhong-Wu Su.A NOVEL COMPOUND FROM FlosCarthami AND ITS BIOACTIVITY.Chemistry of Natural Compounds.2009，45：339-341)。因此，红花中HSYA和IQBA含量的高低，直接影响红花品质的优劣。对红花品质相关功能基因进行研究，对提高红花的产量和质量具有重要意义。

前期研究工作，本发明人应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含羟基红花黄色素A的红花进行差异表达分析，发明了一种筛选含羟基红花黄色素A的红花品种的方法已获得中国专利(中国专利ZL 200810037322.8，发明创造名称：一种含羟基红花黄色素A的红花的筛选方法)。为了更有效地筛选含有效成分种类多的红花，本发明人继续进行研究，发明了另一种筛选含两种有效成分HSYA和IQBA的红花的新方法。

发明内容

本发明目的是提供一种含HSYA和IQBA的的红花的筛选方法。

本发明应用cDNA-AFLP技术结合BSA法对含与不含HSYA和IQBA的红花进行差异表达分析，在红花中找到与HSYA和IQBA紧密连锁的1条基因，该基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。具体方法如下：

本发明以含HSYA和IQBA的红花品系No.16为母本，不含HSYA和IQBA的红花No.25为父本进行杂交，获得F1代种子，F1代种子进行自交加代获得的F2种子，继续种植，从单粒F2种子获得F2代群体共计215个单株。然后进行以下步骤：

1.根据F₂代群体的HSYA和IQBA的含量有无，取等量含HSYA和IQBA的F₂代个体的花冠混成有池，另取不含HSYA和IQBA的F₂代个体的花冠混成无池；

2.提取红花总RNA，反转录成双链cDNA；

3.通过cDNA-AFLP对含有HSYA和IQBA与不含HSYA和IQBA的红花的差异表达分析，在PstI-CT/MseI-AG的引物组合中获得TDF-1一条片段；

4.对该条片段进行回收，克隆和测序。TDF-1具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种含HSYA和IQBA的红花的筛选方法，该方法是用cDNA序列分析方法鉴定红花基因中含有如SEQ ID No.1所示的一个核苷酸序列。

上述序列分析方法包括RT-PCR方法、Northerning Bloting法以及cDNA末端快速扩增(RACE)法等。

上述方法包括以下步骤：

A、根据TDF-1(SEQ ID No.1)序列设计并合成RT-PCR引物，

TDF-1引物：5’-CTTGCAGCCCGATGTGA-3’

5’-CACCATAATAAGCCACCT-3’

B、提取红花的总RNA；