[发明专利]一种分离射干中5-羟基异黄酮类单体化合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及鸢尾科植物射干中异黄酮的分离纯化领域，即利用络合高速逆流色谱从射干中分离纯化高纯度的单体化合物异野鸢尾黄素、野鸢尾黄素和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮的方法。

背景技术

射干为鸢尾科(Iridaceae)植物射干Belamcanda chinensis(L)DC.的干燥根茎，具有清热解毒，消痰利咽的功效。射干中含有多种类型的天然产物，其中异黄酮类化合物为其主要活性物质，具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌等生物活性与药理作用。异野鸢尾黄素、野鸢尾黄素和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮是射干中的主要活性成分。它们是同分异构体，分离难度较大。目前，国内外多采用常规柱色谱和重结晶等传统方法分离纯化这三个目标化合物。这些方法操作繁琐、费时费力，而且固定相对样品有不可逆性吸附作用，造成样品损失严重。另外，由于目标化合物性质极为接近，通常无法在较短时间内使其得到有效分离，需多次重复制备进行纯化。

高速逆流色谱(High-speed counter current chromatography，HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术。它不用任何固体支撑体或载体，因此克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，理论回收率为100％。在应用传统的HSCCC对射干中的异野鸢尾黄素、野鸢尾黄素和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮进行分离时，异野鸢尾黄素和野鸢尾黄素无法得到分离。

发明内容

本发明公开了一种络合高速逆流色谱法分离纯化射干中异黄酮的方法，该技术具有高效、快速，可在不改变硬件的条件下显著改善分离效果的优势。

射干中的主要活性成分为结构极为近似的5-羟基异黄酮类化合物，传统的分离纯化色谱技术无法在短时间内使它们获得较好的分离。本发明采用络合高速逆流色谱法来分离射干中单体化合物，获得了良好的分离结果。

发明人试图利用传统HSCCC对射干中异黄酮的单体进行分离，但由于目标化合物性质极为接近，很难分离，发明人通过在固定相中加入络合剂试图提高分离效果，研究发现，不同的络合剂对射干中异黄酮分离出异野鸢尾黄素、野鸢尾黄素和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮的效果是不同的。

发明人采用不同的络合剂加入固定相中对射干中上述三种单体化合物：异野鸢尾黄素(I)、野鸢尾黄素(II)和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮(III)进行分离，结果见表1。

表1I、II、III在不同络合剂中的分配系数与分离度

^a络合剂浓度为0.1mol/L，溶剂系统为石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3∶5∶3∶5

^b“-”表示在下相中不溶解。

合适的络合剂应具备以下条件：①在下相中具有足够的溶解度；②待分离的化合物的分配系数在0.5-2之间；③化合物的分离度在1.5以上。

由表1可见：硫酸铜在下相中溶解度过小，因此不能使用。使用氯化锌作为络合剂时，异野鸢尾黄素和野鸢尾黄素的分配系数小于0.5，且它们的分离度小于0.5，因此，分离效果不好。使用三氯化铝作为络合剂时，异野鸢尾黄素和野鸢尾黄素的分离度同样无法达到1.5。试验证明只有硝酸铜作为络合剂才能同时满足以上三个条件，达到优异的分离效果。在此基础上形成了本发明的技术方案。

本发明采用络合高速逆流色谱法从射干异黄酮中分离纯化异野鸢尾黄素、野鸢尾黄素和5，7，4′-三羟基-6，3′，5′-三甲氧基异黄酮，方法包括：将石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝2.8-3.2∶4.8-5.2∶2.8-3.2∶4.8-5.2按对应的体积比配制两相溶剂，上相为流动相，下相加入络合剂硝酸铜为固定相，将射干异黄酮溶于上相中，从尾端往高速逆流色谱仪中泵入固定相，待管路充分充满固定相后转动主机，同时泵入流动相，接收目标成分。

其中泵入固定相的流速优选10mL/min。

络合高速逆流色谱的溶剂系统中硝酸铜的浓度优选0.05mol/L-0.15mol/L。

主机转速优选800-900rpm。

流动相泵入速度优选0.8-2.0mL/min。