[发明专利]高效表达重组人神经生长因子的CHO细胞株及其构建方法

权利要求书

1.高效表达重组人神经生长因子的CHO DG44-NGF-118细胞株，其保藏编号为：CGMCC No.4541。

2.根据权利要求1所述的CHO DG44-NGF-118细胞株，其宿主细胞为经过无血清悬浮驯化的CHO DG44。

3.根据权利要求1所述的CHO细胞株，所述CHO细胞株具有编码SEQ ID No.2所示蛋白质的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的CHO细胞株，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.权利要求1-4任一所述的CHO细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)人工合成如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，插入到pOptiVEC-polylinker的多克隆位点，得到重组质粒，

(2)将质粒转入无血清悬浮驯化的CHO DG44的中，

(3)逐步提高氨甲蝶呤浓度的方式加压筛选，得到混合克隆细胞，

(4)采用甲基纤维素半固体培养基进行亚克隆挑选单克隆细胞株，采用ELISA法检测单克隆细胞株的表达量，筛选得到高效表达的重组人神经生长因子的CHO细胞株。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其中核苷酸序列插入到pOptiVEC-polylinker的Xba I和Not I酶切位点之间。

7.根据权利要求6所述的构建方法，所述重组质粒为pOptiVEC/NGF-118，其制备方法包括如下步骤：(A)人工合成如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并连接到pcDNA3.1载体上构建成功pcDNA3.1/NGF-118重组质粒，(B)分别用Xba I和Not I双酶切pcDNA3.1/NGF-118重组质粒和pOptiVEC-polylinker，然后回收酶切后的NGF基因片段和线性化的pOptiVEC载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆扩大培养后提取质粒，用双酶切法和序列测定法鉴定阳性重组子，获得pOptiVEC/NGF-118重组质粒。

8.根据权利要求5所述的构建方法，所述氨甲蝶呤的最终浓度为400nM。

9.根据权利要求8所述的构建方法，所述步骤(3)加压筛选为在含氨甲喋呤浓度为10nM选择培养基开始加压筛选，然后按照浓度分别为20nM，40nM，60nM，80nM，100nM，200nM和400nM的梯度逐步提高选择培养基中氨甲喋呤的浓度。

10.权利要求1-4任一所述CHO细胞株在生产人神经生长因子蛋白质药物中的应用。