[发明专利]一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种对脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA-23S rRNA基因间区(Internal transcribed spacer，以下简称ITS)特异的寡核苷酸及其应用。

背景技术

人类是脑膜炎奈瑟氏菌的唯一宿主。脑膜炎奈瑟氏菌作为条件致病菌，常存在于患者或带菌者的鼻咽腔黏膜中，约有5～10％的健康人鼻咽部带有本菌，流行期高达20～70％，其排菌时间可达数周至2年。病原菌借飞沫直接由空气传播，大部分感染者临床症状不明显，因此很多感染者成为无症状的携带者。在非流行期，发病率在1/10～3/10万左右，而在流行期，发病可高达500/10万，对6个月到2岁的婴幼儿及青少年危害极大，即使在及时和适当的照顾下，该病的致死率也有10％到20％甚至超过50％。大约20％的人群在任何给定时间都有脑膜炎奈瑟氏菌寄生，无论是在发展中国家或是发达国家均可以引起较高的流脑发病率和死亡率。

流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎奈瑟氏菌引起的急性化脓性脑膜炎，为急性呼吸道传染病。我国流脑发病率有明显上升的趋势，暴发流行时有发生，对我国人民的生命健康构成极大威胁。主要临床表现为发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征，重者可有败血症性休克和脑膜脑炎，脑脊液可呈化脓性改变。流行性脑膜炎常见的并发症为关节炎、硬脑膜下积液或积脓。暴发性败血症的致死率高于流行性脑脊髓膜炎。每年大约有一百万人感染细菌性脑膜炎，并有20万人因此死亡。54％的幸存者会留下残疾，包括失聪，智力迟钝、失明、肢体瘫痪、智能及精神改变和脑积水。

目前，对脑膜炎奈瑟氏菌传统的诊断主要依靠对脑脊液的涂片镜检、病原体培养、免疫学检查抗原抗体以及从脑脊液、血液中分离培养出脑膜炎奈瑟氏菌。该法确诊脑膜炎奈瑟氏菌感染至少需2～3天，其中血清学鉴定因其灵敏度不够高，影响因素较多，有时难于作出可靠诊断，尤其在大规模流行病学调查时，常因工作量大，检测者经验不足、情绪波动等主观因素而影响结果可信度。传统方法特异性差、灵敏度低且费时。脑膜炎奈瑟菌对干燥、寒冷、热、阳光等非常敏感，在室温中3小时就死亡，同时受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，单独采用细菌培养方法会导致脑膜炎奈瑟菌漏检。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

核糖体内转录间隔区(ITS)，是介于16S rRNA和23S rRNA之间的区域，在几乎所有细菌的基因组中都以单拷贝或多拷贝的形式存在，相对较短(200bp-1000bp)。该区域进化速率较快，具有超变位点，它的变异速率相当于16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在种内不同菌株间高度保守，而在细菌的种间存在着丰富的变化。因此具有很高的分辨率，更易区分开进化关系很近的菌种，大大增强了检测的特异性。可以为研究细菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。

荧光定量PCR法的检出率高于常规PCR法，并且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高等特点。它的技术更先进，操作更便捷，避免常规PCR反应后检测的烦琐步骤，并能达到实时监测、绝对定量的目的。无论是在阳性符合率和阴性符合率上都要优于分离培养法和直接涂片法，能检测一些不能被培养或者很微量的样品，对样品运输条件也比较宽松。荧光定量PCR法检测脑膜炎奈瑟氏菌具有高灵敏性、高特异性和高精确定量等特点，可为流脑检查提供一种快速、方便的病原学诊断手段，具有实用价值。

该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物及探针介导下的荧光定量PCR过程中扩增目标序列，发出荧光信号，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。荧光定量PCR的扩增过程仅需1个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸；

本发明的另一个目的是提供该特异核苷酸的应用，设计引物和探针，通过优化和设计，提供一种用于检测脑膜炎奈瑟氏菌的荧光定量PCR试剂盒，并利用该荧光定量PCR试剂盒检测脑膜炎奈瑟氏菌的存在。