[发明专利]具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌及其构建法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物工程技术领域的DNA重组技术和应用，具体涉及一种利用转基因工程技术大幅增强生防真菌肠毒杀虫活性的方法。

背景技术

丝孢类昆虫病原真菌是重要的害虫生防真菌，一般通过体壁接触感染致死各类害虫，但通常不具有经口器摄入侵染的肠毒杀虫活性。真菌侵染过程包括分生孢子在昆虫体壁上的附着、萌发及体壁穿透，然后进入寄主血腔并在其中快速繁殖，终因耗尽寄主营养而导致寄主死亡。独特的侵染方式使丝孢类生防真菌成为防治刺吸式口器害虫的首选生防因子。丝孢类生防真菌的成员很多，如白僵菌Beauveria、绿僵菌Metarhizium、棒束孢属Isaria （=拟青霉Paecilomyces）和蜡蚧菌属Lecanicillium（=轮枝菌属Verticillium）等昆虫病原真菌的菌种菌株，是支撑无公害农业的害虫防治新技术及产品来源。目前全世界注册登记的丝孢类真菌杀虫剂近200种，其主要活性成份大都是极易低成本生产的分生孢子，用于多种农林害虫的防治。

丝孢类生防真菌防治害虫的持效性较好，但杀虫速度较为缓慢，成为影响真菌杀虫剂应用推广的限制因素，也是国际上的重大技术难题之一。作为丝孢类生防真菌的典型代表，球包白僵菌穿透害虫体壁通常发生在接种后的48小时左右，再经血腔内的繁殖，一般经历因虫体大小而异的数天潜伏期才能杀死害虫。由于生防真菌没有特异的肠道毒力因子，只能依赖分生孢子萌发后穿透体壁的方式感染寄主，被咀嚼式口器害虫摄入的大量孢子一般不能在肠道导致实质性的感染。真菌杀虫的时滞效应使其很难用于防治暴食性叶面害虫，限制着菌剂的应用范围。因此，有效提高球孢白僵菌对暴食性叶面害虫的快速毒杀能力是一重大技术挑战。Vip3A是一类由苏云金芽孢杆菌在营养生长期分泌的、具有信号肽的杀虫蛋白，直接作用于昆虫中肠上皮细胞(主要是柱状细胞)，诱发昆虫细胞凋亡和核溶解，导致昆虫死亡，对鳞翅目害虫具有较广谱的杀虫活性。然而，Vip3A杀虫蛋白在细胞培养物中的分泌量很低，加之非晶体结构的不稳定性，不能像苏云金芽孢杆菌的晶体内毒素那样开发成可直接用于田间的杀虫剂产品。迄今，全球Vip3A蛋白的应用仅限于转基因抗虫植物。新近的研究表明，利用害虫Vip3A肠毒蛋白改造杀虫真菌，使其不仅能够经昆虫体壁侵染，而且摄入肠道的真菌孢子可释放肠毒蛋白，从而加快低龄斜纹夜蛾幼虫的死亡（Qin et al., 2010）。虽然将Vip3Aa1蛋白基因置于构巢曲霉的通用组成型启动子PgpdA下导入球孢白僵菌能提高其对斜纹夜蛾低龄幼虫的毒杀效果，但重组菌株对三龄以上龄期幼虫的毒杀效果不佳（Qin et al., 2010），说明PgpdA不足以启动外源基因在生防真菌分生孢子中的高表达。因此，有必要寻找一种超强启动子来启动外源杀虫蛋白基因的高效表达，为提升真菌杀虫剂的质量和实用性提供新的技术途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种找到一种超强启动子、能建立生防真菌通常不具有的独特杀虫机制和杀虫活性显著增强的Vip3A杀虫蛋白超高表达的工程菌株构建方法，并获得相应的工程菌株。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌，该菌株BbHV8的保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2010年12月8日，保藏编号：CGMCC No. 4438。

本发明还同时提供了一种具高肠毒杀虫活性的转基因生防真菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）获得内源强启动子：

利用球孢白僵菌疏水蛋白基因hyd1的序列设计引物，克隆其N端启动子全长序列Phyd1（1798 bp）；不同长度或实施转录因子定点突变的启动子片段通过其启动外源报告基因（绿色荧光蛋白基因eGFP）的表达进行定量比较，找到启动绿色荧光蛋白表达量最大的启动子片段为球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段，所述球孢白僵菌疏水蛋白启动子Phyd1的优化片段作为Phyd1优化后的强启动子核心序列，该片段携带3个缺一不可的转录因子；

（2）获得异源杀虫蛋白基因：