[发明专利]产透明质酸重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体是构建用于高效产透明质酸工程菌的重组表达载体pQHK和pHK及其构建方法。

背景技术

大肠杆菌K12株系因清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组的易操作性而被广泛应用在代谢工程领域，以生产各式各样的高附加值产品。目前尚未发现天然的大肠杆菌菌株有生产透明质酸的能力。

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)广泛存在人和动物组织内，其分子量在5×10⁴到8×10⁶道尔顿之间，是由β-1,4-糖苷键连接的葡萄糖醛酸及β-1,3-糖苷键连接的氮乙酰基葡萄糖胺（β1-4 D-Glucuronic acid,GlcA，β1-3 D-N-acetylglucosamine ,GlcNAc）交替连接而成的直链聚合物。研究证实，该多糖作为结构与信号分子参与了哺乳动物的受精、胚胎发育、血管再生和关节润滑等众多生理活动；同时在炎症与损伤修复、维持皮肤的水分与弹性方面也有重要作用。特定长度的HA寡糖链在抗肿瘤免疫异常修复等方面发挥着重要功能。

由于透明质酸独特的化学特性与生理功能， HA及源于HA的寡糖链被广泛应用于眼科手术、关节炎治疗、抗肿瘤、给药方式、化妆品工业等诸多方面，仅2008年HA做为原料，在全球市场的交易金额约为10亿美元并有逐年增加的趋势。

自然界中HA广泛存在，如动物组织哺乳动物病原菌的细胞被膜及病毒PBCV-1浸染的小球藻等。目前商用HA主要从动物组织(如鸡冠，脐带、牛眼、关节滑液)和培养高等哺乳动物（包括人）的病原菌（如链锁状球菌, Streptococci ）中提取(Marcellin E. et al, Proteome analysis of the hyaluronic acid-producing bacterium, Streptococcus zooepidemicusProteome Science 2009, 7:13-20)。出于资源限制、成本问题及药物安全等诸方面的考虑，上述生产绝非理想方式，国际社会极力探索更为经济、安全和持续的生产HA的方法。

分子生物学及生物技术的发展，为上述问题的解决提供了重要的手段。对HA在动物与微生物中合成机理，诸多HA的合成过程必需基因的克隆等研究，都为通过代谢工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途径来生产HA奠定了坚实的基础。

2004年 日本学者祡谷滋郎等（公开号为CN1833026A、名称为“生产透明质酸的植物”）通过在转基因植物中表达从人类和草履虫病毒（PBCV-1）中得到的HA合成基因（Has）来尝试HA在植物组织中的合成。Widner B 等 (Bill Widner et al .,Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtilis Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(7):  3747–3752) 在枯草芽孢杆菌中成功表达从革兰氏阳性的链锁状球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢杆菌在普通的三角瓶中发酵获0.5-0.6g／L HA 含量。

然而在植物中生产透明质酸，因植物的转化难，生长周期受季节限制，许多保守环保人士反对转基因植物，及转基因植物本身存在对环境安全的潜在危害等而受到应用限制。对于枯草芽孢杆菌，因该菌有产生内毒素，各种大环脂类和脂肽类抗生素的报道，而会导致经发酵、用于医药领域HA的分离纯化成本增高，产率降低等系列问题。

许多来源于人体肠道的大肠杆菌是维护肠道微生物平衡及人体健康的有益细菌。加之大肠杆菌K12菌株具清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组可操作性，而被广泛应用在代谢工程领域以生产高附加值的生物产品。对于用大肠杆菌为宿主进行工程改造生产透明质酸的首次报道是美国麻省理工学院的Stephanopoulos G研究组。2008该研究组通过在大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas 和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因，该研究获得最高约 0.2g/L的HA产量。该工程大肠杆菌因HA合成产率低而难以获得产业化运用。因此，研究能在大肠杆菌中生产透明质酸甚至能在其他非大肠杆菌革兰氏阴性细菌中生产透明质酸的重组表达载体是构建高产透明质酸工程菌的关键。

发明内容