[发明专利]产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌。

背景技术

来源于放线菌的次级代谢产物是临床上药物的重要来源，约70％的抗菌药物属于此类。由于这些次级代谢产物结构的复杂性，采用化学方法合成这些化合物成本高、操作繁琐，不能满足大量的商品化生产的需要。而采用原始菌进行次级代谢物的生产，往往菌体生长速度慢、产量低、难培养，遗传背景不清晰，代谢产物不清晰，且很难进行遗传操作，这些因素制约着对有价值的次级代谢产物的开发应用。近年来，次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达成为提高化合物产量或有针对性地改造化合物的有效手段。

在异源表达宿主的选择中，由于假单胞菌与放线菌密码子的使用相近，有翻译后修饰，安全无毒(如模式菌株恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440)，生长快速，次级代谢产物背景清晰等优点，成为首选的宿主菌之一。

P.putida KT2440表达异源产物已有成功的例子，如粘细菌Stigmatella aurantiaca DW4/3-1的全基因组序列分析后发现至少有八个PKS型，NRPS型或PKS/NRPS杂合型的生物合成基因蔟，但常规的发酵和产物的分离纯化只得到Myxothiazol一种化合物，对某“沉默基因蔟”敲除后所得变异株的分析发现，其HPLC图谱比原株少一个特征峰。RulfMuller研究组将此“沉默基因蔟”克隆后，转化至P.putidaKT2440中，在苯甲酸诱导下，得到了PKS/NRPS型化合物Myxochromide，发酵2天产量就达到了40mg/mL，而原株发酵7天的产量仅为8mg/mL。因此，可以通过基因工程方法大量地获得新的、有潜在应用价值的化合物，为进一步的药效学研究提供充足的原料来源。

但恶臭假单胞菌不能全面地提供复杂的次级代谢产物生物合成所需的小分子前体。如很多次级代谢产物需要以2S-甲基丙二酸辅酶A(2S-Methylmalonyl-CoA，2S-mmCoA)作为延伸单位，而在恶臭假单胞菌中不能检测到2S-甲基丙二酸辅酶A的存在。虽然已有报道可进行化学合成2S-甲基丙二酰辅酶A，但化学合成成本大，技术难度高，而且很难得到单一的光学异构体产物，并且由于其不稳定性很难直接供给微生物作为合成底物利用，而2S-甲基丙二酰辅酶A在细胞内生成可直接用于次级代谢产物的合成，可大大降低发酵成本。因此在异源表达宿主菌中合成2S-甲基丙二酰辅酶A是最佳选择，构建能够产生2S-甲基丙二酸辅酶A的基因工程菌株，是异源表达需要以之作为前体物质的次级代谢产物的基础，有着广泛的应用价值。

已知生物体内有两个2S-甲基丙二酸辅酶A的生物合成途径。一是MCM途径，即以三羧酸循环中的琥珀酰辅酶A为起始化合物，通过甲基丙二酰辅酶A变位酶(MCM)和甲基丙二酰辅酶A变位酶复合物保护蛋白(MeaB)的作用生成2R-甲基丙二酰辅酶A，再通过甲基丙二酰辅酶A异构酶(Epi)的作用而生成2S-甲基丙二酸辅酶A。另外一条是PCC途径，即首先从L-丙氨酸、L-异亮氨酸或L-甲硫氨酸生成(或以奇数位脂肪酸降解)而获得丙酰辅酶A，继而在ATP的参与下通过羧化酶的作用生成2S-甲基丙二酸辅酶A，参与该过程的基因包括丙酰-CoA羧化酶基因和羧化酶复合物A亚单位基因。

为了异源表达需要以2S-甲基丙二酸辅酶A作为前体单元的myxothiazol，德国Rolf Muller研究组将粘细菌Sorangium cellulosumSoce56全基因组中成簇的mcm、epi和meaB三个基因通过同源重组整合至假单胞菌P.putida KT2440的基因组中，所得菌株发酵后，经气相色谱和质谱连用(GC/MS)检测表明可产生4.68nmol/mL的2S-甲基丙二酸辅酶A。然而，该菌株2S-甲基丙二酸辅酶A的产量较低，直接影响了最终次级代谢产物的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌。

为了实现本发明目的，本发明的一种产2S-甲基丙二酰辅酶A的假单胞工程菌，其是将来源于天蓝色链霉菌(Sterptomyces coelicolor)的编码丙酰-CoA羧化酶的pccB基因和编码羧化酶复合物A亚单位的accA1基因与筛选标记基因一起整合至恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KT2440的基因组中而获得。其中，所述筛选标记基因为卡那霉素抗性基因或庆大霉素抗性基因。