[发明专利]一种耐有机溶剂高活性脂肪酶产生菌及其所产脂肪酶的基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程与酶工程技术领域，具体涉及一种耐有机溶剂脂肪酶产生菌，其耐有机溶剂脂肪酶的基因，以及该耐有机溶剂脂肪酶在有机相中催化拆分手性醇的应用。

技术背景

脂肪酶(EC3．1．1．3)是一种酯键水解酶，它可在油水界面催化长链甘油三酸酯水解形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸，在洗涤、制革、食品、生物化工、造纸、医药、环保等行业被广泛应用。

脂肪酶在有机相中可以完成酯化、交换及转酯等反应，并具有区域选择性、立体选择性、较高的稳定性，尤其是它的立体选择催化特性，可以用于化学法难以进行的消旋化合物的拆分、不对称合成等。近年来，国内外学者已经致力于应用脂肪酶在有机体系中实现手性化合物，尤其是药物中间体的立体选择性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反应停、心得安等手性药物的立体选择性水解或拆分。与传统的化学方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反应条件温和、节省能源、专一性强、副反应少、产品纯度高、反应步骤简单、不需手性源、产品成本低等优点。

脂肪酶在有机溶剂中容易变性或使酶活力下降，虽然国内外许多学者已经研究了不同方法来增加酶在有机溶剂中的稳定性，但其还是无法满足工业化的需求。因此寻找天然耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐有机溶剂脂肪酶的产生菌、耐有机溶剂脂肪酶、耐有机溶剂脂肪酶基因以及该脂肪酶在有机相中催化手性醇拆分的应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先从油污土壤等样品中筛选获得一株有机溶剂脂肪酶产生菌，分类命名为洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia RQ-3，保藏日期为2010年12月5日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏登记号为CCTCC NO：M 2010330。

本发明对洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia RQ-3的生物学特征进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性菌株，菌落呈浅黄色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；显微镜观察菌体为杆菌，0.8～1.0×1.6～3.2mm，专性好氧，生长的最适温度为30℃～35℃。其生理生化特性表现在：不出现反硝化反应、明胶反应结果为阳性，氧化酶阳性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麦芽糖。

经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，Sim值为0.535（24h培养），结果显示该菌属于Burkholderia属；16S rDNA序列分析结果表明，该菌株与数据库中多株Burkholderiacepacia菌的同源性为99%。综合BIOLOG和16S rDNA分析结果，该菌株鉴定为Burkholderia cepacia，命名为Burkholderia cepacia RQ-3。

本发明对Burkholderia cepacia RQ-3进行了产酶条件优化，优化后产酶量高达71 U/mL，比优化前21.9 U/mL提高了2.2倍。

本发明对该菌产生的胞外酶进行了纯化，经过一步Phenyl-Sepharose FF层析，分离纯化得到电泳纯的耐有机溶剂脂肪酶，命名为脂肪酶RQ-3，纯化后脂肪酶的比活性达到4142.3 U/mg。

本发明对脂肪酶RQ-3进行了酶学性质的研究，实验证明该脂肪酶对多种有机溶剂都具有良好的耐受性，有机溶剂体系（十六烷、十四烷、异丙醇、乙醇等）中脂肪酶的稳定性提高，半衰期延长。脂肪酶RQ-3的最适反应pH为9.0，在pH 6.0～10.0的范围具有很高的稳定性。其最佳反应温度为40℃，此酶的最佳人工底物为对硝基苯酚豆蔻酯（C14）。