[发明专利]一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法

权利要求书

1.一种抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，进行EGS位点的选择：RNase P 在EGS引导下对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因片段mRNA进行切割的靶序列区域的确定，靶RNA的高效切割位点一般具备以下特征，即切点的-1和+1位应分别为嘧啶(U/C)和鸟嘌呤(G)，切点的+8位最好应为尿嘧啶(U)，根据序列通式5’-U/CGNNNNNNＵ-3’在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻潜在切点，在流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因中搜寻到3个潜在切点，分别为从翻译起始开始的第15, 1224, 222位核苷；

步骤二，对EGS进行设计合成：EGS的结构通常由5’结合区序列、tRNA的T茎环与额外环区序列及3’结合区序列三个部分组成，其中，T茎环与额外环区序列是固定的，全部EGS的该部分序列均选自于人tRNA，5’结合区和3’结合区序列在不同EGS则不相同，在潜在切点已确定的情况下，根据该切点附近的序列，按照碱基互补配对的原则，设计针对该切点的EGS结合区序列，靶RNA与EGS两侧结合区互补的序列之间应间隔2nt，EGS结合区序列至少具备12nt以尽量保证互补结合的特异性，所设计的全部EGS的结合区序列长度为14-16nt ，5’结合区和3’结合区序列的长度各为7-9nt；

步骤三，针对流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因位点的序列，设计合成的三个EGS分别为E-PA、E-PB1、E-M1，它们的序列分别为：

E-PA序列：

5’-GGUUAACAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCUUGUCGC

ACCA-3’；

E-PB1序列：

5’-GUAUUGAAGGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCGCCCAUCACC

A-3’；

E-M1序列：

5’-GCAAAGCGCGUGCGGUCUCCGCGCGCAGGUUCAAAUCCUGCACGCUGCACC

A-3’；

步骤四，将设计好的三个EGS序列进行合成，用无菌三蒸水将合成后的EGS冻干物溶解，并稀释至100 uM，制得EGS核酸药物，EGS核酸药物分装保存于-20℃、-80℃，备用；

步骤五，对EGS核酸药物进行药物筛选；

步骤六，最后检测EGS核酸药物对靶向序列在细胞水平对流行性感冒病毒的复制具有抑制作用。

2.根据权利要求1所述的抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，其特征是步骤四中对三个EGS序列进行合成时添加2’-O-methyl进行化学修饰。

3.根据权利要求1所述的 抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，其特征是步骤五对EGS核酸药物进行药物筛选的方法是首先进行细胞外靶向引导切割实验，从人细胞HeLa cells中提取具体外切割活性的RNase P，体外转录流行性感冒病毒PA、PB1、M1基因mRNA结合设计合成的EGS建立了一种细胞外筛选系统，通过细胞外筛选系统验证所设计EGS的靶向引导切割活性。

4.根据权利要求1所述的 抗流行性感冒病毒EGS核酸药物的制备方法，其特征是步骤六采用以下方法检测：将细胞外初筛及胞内复筛证实有效的EGS分别以脂质体转染MDCK细胞，然后再以流行性感冒病毒感染，在感染6h、12h、24h、48h和72h后，抽提感染细胞的总RNA，通过Northern blot的方法在细胞水平分析EGS对病毒复制的抑制能力，并在感染6h、12h、24h、48h、60h、72h和96h后吸取MDCK细胞及培养上清测其病毒滴度，并绘制病毒生长曲线，通过病毒生长曲线评价三个EGS1对细胞内流行性感冒病毒复制的抑制活性。