[发明专利]一种固定化酶合成L-色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过固定化酶法合成L-色氨酸。

背景技术

L-色氨酸是人体和动物生命活动中八种必需氨基酸之一，对人和动物的生长发育、新陈代谢起着非常重要的作用，广泛应用于医药、食品和饲料等诸多方面。L-色氨酸的生产最早主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是随着对微生物法生产色氨酸研究的不断深入，这种方法已经走向实用并且处于主导地位。微生物法大体上可以分为直接发酵法、微生物转化法和酶法合成法。其中酶法合成法是利用微生物中色氨酸生物合成酶系的催化功能生产色氨酸。酶法能够利用化工合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点，是一种较为有效的廉价生产L-色氨酸的方法。转化途径主要涉及色氨酸合成酶（EC 4.2.1.20）及色氨酸酶（EC 4.1.99.1），二者均可催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸。尽管前者动力学特征明显优于后者, 但吲哚对其具有强烈的抑制作用，而色氨酸酶对吲哚则具有良好的稳定性，所以近年来人们更为关注色氨酸酶，并将其用于L-色氨酸的生物合成。

色氨酸酶正常情况下降解L-色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度丙酮酸和氨的条件下也能有效的催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸。该酶还能催化L-丝氨酸或L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸的酶法途径中，由于底物吲哚对色氨酸酶抑制作用较弱，且丙酮酸价格不高，因而具有一定的实用性，但该途径是色氨酸水解的逆反应，要求底物浓度较高，反应平衡不易把握。以L-丝氨酸和吲哚为原料合成L-色氨酸的酶法途径，底物L-丝氨酸的价格几乎与L-色氨酸相当，因此实用性不强。

2000年，韦平和等报道了利用色氨酸酶基因工程菌催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的工艺，产物总回收率达到70%。该技术以工程菌为酶源，不利于后续的分离纯化，并且不能重复利用，成本相对较高。本发明采用固定化酶为酶源，可以反复利用至少10次，并且易于分离。由于底物L-半胱氨酸价格较为低廉，因此该酶法途径具有重要的工业化应用价值。

发明内容

本发明的目的是为L-色氨酸的绿色生产提供一种固定化酶合成L-色氨酸的方法，解决现有技术成本高，难分离等缺点。

本发明涉及基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET21a(+)-tnaA，以底物L-半胱氨酸出发，经基因工程菌表达的L-色氨酸酶直接催化L-半胱氨酸和吲哚反应，制备L-色氨酸。

本发明自行构建了高效表达L-色氨酸酶的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET21a(+)-tnaA，即以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增L-色氨酸酶基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，酶活力可达3912.6 U/g，其中大肠杆菌BL21(DE3)以及对应的表达载体pET21a(+)均为文献报道和商业化可利用的表达体系。

以上述重组菌株的菌体为酶源，本发明建立了以L-半胱氨酸和吲哚为底物，经酶促反应生物合成L-色氨酸的方法。

本发明提供的固定化酶合成L-色氨酸的方法具体包括：

将色氨酸酶进行固定化，获得固定化酶，以固定化酶为酶源，以L-半胱氨酸和吲哚为底物，在35至55℃下，pH值为6至11，经酶法转化反应1至5h，产生L-色氨酸，过滤去除固定化酶后进一步分离获得L-色氨酸。

优选转化温度为45℃；优选转化pH值为8.5；优选转化时间为3 h。

L-色氨酸的纯化方法是，调节催化反应上清液pH至5.0，采用S-8型大孔树脂去除残留的吲哚，再采用NKA-Ⅱ型大孔树脂吸附L-色氨酸，经50%(v/v)乙醇洗脱、减压浓缩干燥，获得L-色氨酸。

以上酶促反应过程中，向反应体系中加入固定化酶5 mL/L至50 mL/L，底物L-半胱氨酸和吲哚按质量比1：1加入，分别为2 g/L至25 g/L，辅酶磷酸吡哆醛的量为0.05 g/L ~0.25 g/L。

底物L-半胱氨酸和吲哚的用量优选分别为10 g/L；辅酶磷酸吡哆醛的优选用量为0.15 g/L 。

固定化酶使用的载体为GE、ES-2、0404-2树脂。优选为GE树脂。

所述的固定化酶可重复使用10次，且在最佳的反应条件和体系下，前5次使用，其催化底物转化率均可达80%以上。

在本发明实施例中，采用HPLC法来测定L-色氨酸的含量，色谱条件：