[发明专利]猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的猪传染性胃肠炎的检测方法，具体涉及一种猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎病毒TGEV与猪流行性腹泻病毒PEDV引起的疾病在临床症状上极为相似；基因组结构上，猪呼吸道冠状病毒PRCV与猪传染性胃肠炎病毒TGEV具有较高的同源性，传统诊断方法很难区别。目前，猪传染性胃肠炎TGE和猪流行性腹泻PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、酶联免疫法ELISA和反转录聚合酶链式反应法等。

酶联免疫法ELISA需要制备抗体，周期较长；外界影响因素对酶联免疫法ELISA诊断方法的干扰性比较大；酶联免疫法ELISA诊断方法不能鉴别猪传染性胃肠炎病毒TGEV和呼吸冠状病毒PRCV。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用现代分子生物学技术，通过生物学软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV引物，并通过条件优化，建立了猪传染性胃肠炎病毒TGEV的多重反转录聚合酶链式反应鉴别诊断方法。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

 一种猪传染性胃肠炎多重的反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的方法有八步，分别为猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物设计与合成、猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR氯化镁MgCl2浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP浓度优化、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR最佳退火温度的确定、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR敏感性试验、二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR特异性试验。

所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的引物设计与合成；根据基因库GenBank上已发表的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV的纤突蛋白S蛋白基因序列，比较分析保守序列，按反转录聚合酶链式反应RT-PCR和多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR引物设计原则，通过欧立格Oligo6.0及普来模Primer5.0软件设计猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV基因引物，各基因引物序列和扩增片断大小见表2。1所述的猪传染性胃肠炎多重反转录聚合酶链式反应检测方法，所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV多重反转录聚合酶链式反应RT-PCR诊断方法的建立；

所述的猪传染性胃肠炎病毒TGEV和猪流行性腹泻病毒PEDV二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系

    建立如下二联反转录聚合酶链式反应RT-PCR反应体系，总体积为25μL:

超纯水（ddH20）                                      7.87μl

缓冲液（10×PCR Buffer）                             5.0μl

三磷酸碱基脱氧核苷酸[dNTP Mixture(2.5mmol/L)]        4.0μl

P3（10μmol/L）                                       0.5μl

P4（10μmol/L）                                       0.5μl

P5（10μmol/L）                                       0.5μl

P6（10μmol/L）                                       0.5μl

猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）互补脱氧核糖核酸(cDNA)     2.0μl

猪流行性腹泻病毒（PEDV）互补脱氧核糖核酸(cDNA)       2.0μl

氯化镁[MgCl₂ (25mmol/L) ]                             2.0μl