[发明专利]致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及海水养殖动物病原检测技术，具体是涉及海水养殖动物致病性弧菌的核酸等温扩增通用检测试剂盒及检测方法。

背景技术

致病性弧菌是海洋环境中常见的病原菌类群之一，引起的弧菌病是一种流行范围广，危害严重的传染性疾病，可危害鱼类、甲壳类和贝类等多种海水养殖动物，对海水养殖业造成了巨大的经济损失。随着海水养殖业的蓬勃发展，弧菌病频繁发生，常见病原种类有哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、创伤弧菌(V. vulnificus)、弗氏弧菌(V. furnissii)、河流弧菌(V. fluvialis)、拟态弧菌(V. mimicus)、鳗弧菌（V. anguillarum）等，其中大多数种类还是人类的致病菌。对由致病性弧菌中的不同种类感染引起的海水养殖动物病害，在养殖生产中采用的具体预防或控制措施基本上是相似的，海水养殖动物患病后，养殖场（户）关心的是养殖种类是否被致病性弧菌所感染，而不太会去关心是哪一种致病性弧菌所感染，因此建立一种致病性弧菌的通用检测方法及检测试剂盒是非常有必要的。但现行的弧菌检测方法针对样品单一，而且操作步骤繁琐，不易实现现场批量检测，很难满足海水养殖动物病害防治的需要。现行检测致病性弧菌主要有三种方法：①生理生化鉴定法，该法操作步骤繁琐，费时费力；②酶联免疫吸附试验（ELISA），该法虽检测快速、灵敏度高、可用于大批量检测等特点，但对新鲜样品进行检测时易出现假阳性问题，在一定程度上限制了在生产实践中的应用；③聚合酶链式反应法（PCR），该法快速、灵敏，但需要昂贵的核酸扩增仪，同样限制了在生产实践中的应用。

近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP)，是一种新型的恒温核酸扩增方法，可以有选择性地高效扩增靶基因序列，产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现出不同大小区带组成的阶梯式图谱。LAMP与其它致病性弧菌检测方法相比优点明显：①虽然反应原理、引物设计比较复杂，但是在恒温条件下扩增，只需要一个恒温装置（如水浴锅、保温杯等）就可以进行；②高效灵敏，模板仅需要10个拷贝或更少；③特异性强，应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；④检测时间短，扩增可以在60min内完成；⑤产物可以通过直接在反应管中加入荧光染料染色，结果形象直观。尽管现已有LAMP方法用于弧菌检测，如副溶血弧菌（中国专利申请号：200710046637.4，200710030441.6，200710026389.7，200810030340.3；Wataru Y, 2009）、霍乱弧菌（中国专利申请号：200710030446.9；Srisuk C, 2009）、拟态弧菌（中国专利申请号：200710026390.X）、河流弧菌（中国专利申请号：200710026391.4）、创伤弧菌（中国专利申请号：200810151271.1；Han F, 2008；Ren C H, 2008），但均是针对弧菌属中细菌的单一种类。而在海水养殖生产中养殖动物面临被多种致病弧菌感染的可能，实践中养殖生产者更加关心的是致病病原是否是弧菌，而不必知道是哪一种弧菌所感染，因此在海水养殖领域建立一种致病性弧菌的通用检测方法及检测试剂盒是非常有必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、检测灵敏度高且易现场大批量操作的海水养殖动物致病性弧菌通用检测方法及所用的核酸等温扩增通用检测试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种海水养殖动物致病性弧菌核酸等温扩增通用检测试剂盒，该试剂盒包括：

(1)、研磨液管：内装研磨液，

(2)、核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液，

(3)、核酸提取液B管：内装无水乙醇，

(4)、核酸提取液C管：内装质量浓度70%的乙醇溶液，

(5)、TE缓冲液管：内装TE缓冲液；

(6)、UNG酶管：内装尿嘧啶DNA糖基化酶；

(7)、LAMP反应液管：内装LAMP反应液；

(8)、Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；

(9)、显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；

(10)、阳性对照核酸管：内装弧菌阳性DNA；

(11)、阴性对照管：内装灭菌的双蒸水。