[发明专利]蜱的抗凝血蛋白及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2及其基因和应用。

背景技术

在生物进化过程中，哺乳动物形成了一个复杂的凝血系统来阻止血液的流失，而很多以血液为生的生物体内往往存在很多抗凝血蛋白以对抗宿主的凝血功能。蜱是一类以吸血为生的体外寄生虫。与其他吸血节肢动物相比，蜱的吸血时间特别长，如硬蜱的吸血时间一般在10-14天(Sonenshine，1993)。蜱的长时间吸血过程，必然引起宿主一系列止血反应，如血管收缩、血小板凝集和血液凝固。为了进行持续的吸血，蜱必须克服宿主的止血反应，自从Waxman(1990)鉴定出第一个蜱的抗凝血分子以来，研究人员发现蜱的唾液腺在吸血过程中分泌产生多种抗凝血分子，如凝血酶抑制蛋白分子、凝血因子Xa(FXa)抑制蛋白分子和组织因子通路抑制蛋白分子(TFPI)等，已在美洲花蜱、变异革蜱、间突硬蜱、具尾扇头蜱、微小牛蜱等多种国外优势蜱体内被发现(Maritz-Olivier，2007)。尽管已报道的蜱抗凝血分子多达20多种，但完全鉴定的还很少。从目前的结果分析，蜱抗凝血分子多数属于Kunitz家族丝氨酸酶特异性抑制分子，特征性含有1个或2个KU结构功能域和高度保守的半胱氨酸残基，在进化上可能来自同一祖先(Lai，2004)。

由于血栓引起的人心、脑血管疾病严重威胁着人类健康，目前可用的抗栓制剂有限，因此，抗栓药物的研究一直是十分关注的领域(Bates and Weitz，2006)。根据水蛭(蚂蝗)抗凝血分子合成的抗凝血多肽Hirudin已被应用于医学临床(Turk，2006；Bates and Weitz，2006)。在已经鉴定的蜱抗凝血分子中，有2个分子在动物模型实验中具有抗血栓治疗作用，其中1990年鉴定的TAP分子为凝血因子Xa(FXa)抑制剂，重组表达的TAP在多个动物模型上都显示了良好的抗血栓作用，由于抗原性等原因目前还未能在人体临床上使用(Bates andWeitz，2006)，但利用TAP分子的结构和作用机制设计更小的、没有抗原性的抗栓药物，或者构建新型重组抗栓药物分子正在研究并取得进展，例如，应用TAP功能区序列和锚定蛋白Annexin V序列构建一个新的重组抗凝血蛋白分子，其抗血栓活性比单个锚定蛋白Annexin V的活性提高10倍(Chen，2005)。另一个蜱抗凝血分子Ixolaris，是近年从间突硬蜱鉴定的分子，与人的组织通道抑制因子(TFPI)同源，抑制凝血因子VIIa/组织因子复合体，在大鼠模型中，显示了很强的抗血栓作用(Monteiro，2005；Nazareth，2006)。这些研究表明，蜱的抗凝血分子可以开发为新型抗血栓药物。

镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)主要分布于南亚及中国南方，是中国优势蜱种之一，在牛、羊、狗、兔等多种动物吸血寄生。申请号为200910053692.5、公开号为CN101928710A的中国专利申请，公开了一种镰形扇头蜱的抗凝血分子Rhipilin-1的基因序列和重组表达与应用。但是，目前仍缺乏能开发为新型抗血栓药物的蜱抗凝血蛋白，关于镰形扇头蜱的其他抗凝血蛋白国内外尚没有公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种蜱的抗凝血蛋白及其基因，该抗凝血蛋白为镰形扇头蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2，可用于制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂。

此外，还需要提供一种蜱抗凝血蛋白的重组表达方法及其在制备抗凝血药物或抗凝血生物制剂中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种蜱的抗凝血蛋白，所述抗凝血蛋白为镰形扇头蜱的抗凝血蛋白Rhipilin-2，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种蜱的抗凝血蛋白基因，所述基因为镰形扇头蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2基因，其包含：编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述抗凝血蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述镰形扇头蜱抗凝血蛋白基因的重组载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的细胞。

在本发明的另一方面，还提供了一种蜱抗凝血蛋白的重组表达方法，包括以下步骤：

构建含镰形扇头蜱抗凝血蛋白Rhipilin-2编码基因序列的真核表达重组载体；

将所述重组载体转化至大肠杆菌细胞，筛选获得重组杆状病毒粒；