[发明专利]基于杜氏盐藻代谢途径的番茄红素工程菌及构建方法

权利要求书

1.基于杜氏盐藻代谢途径的番茄红素工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从杜氏盐藻中获取相关基因的cDNA

从对数生长期的杜氏盐藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得杜氏盐藻的总cDNA；

以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P1：5’-CCGCTCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC-3’和下游引物P2：5’-ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTCTTGG-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA；

以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3：5’-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3’和下游引物P4：5’-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA；

以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5：5’-CGACGCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG-3’和下游引物P6：5’-ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGAAGTG-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA；

(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取

从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P7：5’-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3’和下游引物P8：5’-ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAGGAAAG-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子；

(3)p15A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取

依次用内切酶Cla I在30℃下和Hind III在37℃下对质粒pVA838处理1h后，纯化并回收DNA片段；利用T4 DNA聚合酶对获取的DNA片段进行平末端化，纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA连接酶使DNA自身环化为质粒pcmp15A，质粒pcmp15A转化大肠杆菌DH5α进行增殖；

(4)质粒的构建

纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在T4DNA连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒pcmp15A的DNA片段进行连接，获得质粒pDsA；

依次用内切酶Xho I和Pvu I对质粒pDsA和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA在37℃下处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDsB；

依次用内切酶Cla I在30℃下和Pvu I在37℃下对质粒pDsB和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDsC；

依次用内切酶Mlu I和Pvu I对质粒pDsC和纯化后的杜氏盐藻ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA在37℃下处理1h，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDscrtA；质粒pDscrtA转化大肠杆菌DH5α后获得番茄红素工程菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒pcmp15A的纯化和碱性磷酸酶处理是利用内切酶EcoR V对质粒pcmp15A在37℃下处理1h后，纯化并回收DNA片段，再用碱性磷酸酶对回收的DNA片段进行去磷酸化，纯化并回收DNA片段；

所述杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的纯化是利用T4 DNA聚合酶对获取的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子进行平末端化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反转录获得杜氏盐藻的总cDNA的反应程序为：42℃，1h；70℃，15min。

4.一种由权利要求1～3任意一项所述的方法制得的番茄红素工程菌，菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(pDscrtA)，呈粉红色。

5.根据权利要求4所述的番茄红素工程菌，其特征在于，该菌株利用杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶来合成番茄红素。