[发明专利]基于巴氏杜氏藻代谢途径的番茄红素工程菌及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于巴氏杜氏藻代谢途径的番茄红素工程菌及构建方法，具体地说涉及从巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)中获取八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)等基因的cDNA并构建出高产番茄红素的工程菌。

背景技术

类胡萝卜素是具有共轭聚烯结构的一类物质。在医学上，类胡萝卜素具有预防和治疗心血管疾病、白内障以及某些癌症等功能。此外，类胡萝卜素也被广泛应用于动物饲料、食物和化妆品中。营养保健、医药、食品以及化妆品上的广泛应用使得类胡萝卜素在世界范围内有着较高的需求量。番茄红素对单线态氧的猝灭能力分别是β-胡萝卜素和α-生育酚的2倍和100倍。流行病学还发现番茄红素能降低癌症和冠心病等慢性疾病的发生几率。据市场研究机构调查显示，2004年的类胡萝卜素的市场销售总额为8.869亿美元，到2009年它将突破10亿美元。巴氏杜氏藻(Eukaryota总界、Viridiplantae界、Chlorophyta门、Chlorophyceae纲、Chlamydomonadales目、Dunaliellaceae科、Dunaliella属)在应激条件下能够大量积累β-胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10％。因此，从分子生物学角度构建带杜氏藻类胡萝卜素合成基因的高产工程菌株有着重大的社会和经济意义。分子生物学分析显示，类胡萝卜素途径的酶是单一的基因产物，它们催化特定的反应。从番茄红素到玉米黄素或者α-胡萝卜素不需要所有酶一齐起作用。此外，不同的酶组合形成的途径产生各种各样的类胡萝卜素。因此，利用杜氏藻类胡萝卜素途径的相关基因，通过相关基因工程手段来构建类胡萝卜素高产菌株对提高类胡萝卜素的产量具有根本上的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于巴氏杜氏藻代谢途径构建的番茄红素工程菌及构建方法。本发明通过利用相关基因工程手段获取巴氏杜氏藻类胡萝卜素合成途径的八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)等基因的cDNA，并利用p15A复制起始位点，氯霉素抗性基因以及巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子构建出质粒pDbcrtA。转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(Bacteria总界、Proteobacteria门、Gammaproteobacteria纲、Enterobacteriales目、Enterobacteriaceae科、Escherichia属、Escherichia coli种)(细菌呈白色)后获得一种呈粉红色的番茄红素高产工程菌Escherichia coli DH5α(pDbcrtA)。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

基于巴氏杜氏藻代谢途径的番茄红素工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)从巴氏杜氏藻中获取相关基因的cDNA

从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得巴氏杜氏藻的总cDNA；

以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P1：5’-CCGCTCGAGATGGCACAGCGAACAGCAAC-3’和下游引物P2：5’-CCATCGATGGGACGCGTTTATTTGTTCTTGGGCAC-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3：5’-CGACGCGTATGCAGGTTATGCAGGGCAGG-3’和下游引物P4：5’-CCATCGATGATCGATCGTTAGAACCAAGGGAAGG-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA；

以巴氏杜氏藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5：5’-ATCGATCGATGTTGGGGCTGCACAGCAAGG-3’和下游引物P6：5’-CCATCGATGGGCTTAAGTTACATGCTCGGAAGTG-3’进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA；

(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取