[发明专利]沙冬青抗寒基因AmGS

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家二级濒危保护植物，也是至今在亚洲中部荒漠地带唯一保留下来的常绿阔叶木本植物沙冬青的抗寒基因AmGS的分子克隆和遗传转化。通过低温诱导和差异表达分析，获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST片段，然后通过RACE扩增获得了沙冬青抗寒基因AmGS的全长cDNA序列，在基因库中进行了注册，注册为DQ519359。AmGS含有完整的ORF区域，ORF全长987个核苷酸，编码328个氨基酸和一个终止密码子(TAA)。随后构建了沙冬青抗寒基因AmGS的真核表达载体pCAMBIA2300-AmGS，用于转化拟南芥和林木，获得的转基因植株抗寒性有所提高。AmGS是国际上克隆并完成转化木本植物的第一个木本植物抗寒基因，我们拥有完全独立自主的知识产权。它的克隆和成功转化对于木本植物抗寒基因研究和遗传育种具有重要意义。

二、背景技术

低温是限制植物的生长，发育和分布的重要因素，2007-2008年在我国南方大面积发生的那场冻害，我们还记忆犹新，其中对木本植物造成的危害最重，而且其影响将持续在其后十几年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及鱼类和昆虫。但从另一个角度来看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木质化构造，冬季能够发展出较强的抗寒性，所以从木本植物中应该更容易分离到有较强抗寒效果的基因。把这样的基因转化到需要的木本植物中可能会比转化来自于其它生物的抗寒基因更为有效。所以从木本植物中克隆抗寒基因并研究它们的表达和功能，具有重要的理论意义和应用价值。

植物抗寒基因工程与其它抗性基因工程相比起步晚，发展慢，直到八十年代末，才报道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通过以下五个途径进行：①鱼类及昆虫抗冻基因途径；②脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径；③超氧物岐化酶(SOD)基因途径；④糖类基因途径；⑤本草植物抗冻基因途径。其中用的最早的是鱼类抗冻基因途径，鱼类抗冻蛋白(AFP)吸附于冻晶上，使极地鱼类有抗冰晶化作用，保护极地鱼。1989年，Cutler用极地鱼黄盖鲽抗冻蛋白处理植物组织，明显改善了马铃薯、草菁和拟南芥属叶子的抗寒性能。George把人工合成的黄盖鲽AFP基因，通过电激法成功导入玉米原生质体，得到表达。Sallis以农杆菌介导，把合成的PHA-AFP(PHF：植物凝集素)融合基因转入到马铃薯中，马铃薯的抗冻与耐冻能力提高了。近年来植物抗冻基因的研究有了较好的进展，美国和中国的科学家分别克隆了拟南芥的抗冻基因并导入番茄，得到良好的表达，获得了抗寒性提高的转基因植株。美国DNA植物技术公司把抗冻基因导入到蕃茄中，培育出耐寒蕃茄，并且认为抗冻蛋白有可能应用于所有蔬菜品种的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和转化方面迄今尚未见成功报道。本研究结果正是希望在这个领域打开突破口而开展起来的。

三、发明内容

本研究用我国西北荒漠地区一种常绿阔叶的豆科灌木沙冬青为材料，进行了木本植物冷诱导基因的克隆和功能分析研究。通过低温诱导处理和差异表达分析，获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST序列十三个(包括八个全长基因和五个cDNAs的部分序列)。其中的一个(基因库注册号DQ519359)包含沙冬青抗寒基因AmGS(coding sequence of galactinol synthase in Ammopiptanthus mongolicus)的全长cDNA序列，其ORF区域长987个核苷酸，编码328个氨基酸和一个终止密码子(TAA)(图1)。随后克隆了相应的核DNA序列，结构分析表明，AmGS基因核DNA序列含有3个外显子和2个内含子。

我们用双元克隆载体pCAMBIA2300(购自公司澳大利亚Cambia公司，其结构见附图2)，构建了AmGS基因的植物表达载体。在构建目的基因AmGS的表达载体时，将分子克隆得到的AmGS基因片段在Xba I和Sal I双酶切位点插入到载体pCAMBIA2300中，建成的表达载体被命名为pCAMBIA2300-AmGS(图3)。所用的标记基因是广泛应用的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性。在构建本表达载体时考虑到融合基因太大会影响表达，因此没包含报告基因GUS.

该基因转化到植物体内后可以抑制冰晶生长及新冰晶的形成，从而保护细胞免受损伤，提高植物的耐寒性。由于AmGS基因来源于木本植物，转化后在木本植物宿主体内更容易表达，转化的植物对环境没有任何影响。

四、具体实施方式