[发明专利]大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体及应用

权利要求书

1.一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体，其特征在于：它是在pCAMBIA3301的EcoR I和Xba I酶切位点中，插入大豆种子特异性启动子7αP，在Xba I和Pst I酶切位点中，插入了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA反义连接片段SBAF-KTiF，在Pst I和Bgl II酶切位点中，插入了绿色荧光蛋白GFP基因片段，在Bgl II和BstE II中插入了大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA正义连接片段KTiZ-SBAZ。

2.根据权利要求1所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体，其特征在于：所述的KTi、SBA、7αP和GFP其核苷酸序列依次分别如：SEQ ID No.1、2、3和4所示；所述的连接片段SBAF-KTiF或KTiZ-SBAZ在KTi和SBA之间引入了酶切位点Sal I。

3.根据权利要求2所述的一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RN Ai表达载体，其特征在于：所述的7αP、KTi、SBA基因片段均来自于吉农17。

4.一种大豆胰蛋白酶抑制剂KTi和凝集素SBA双价RNAi表达载体制备方法，该方法包括：

1)提取大豆吉农17总RNA，反转录成cDNA；以反转录成的cDNA为模板，用引物：

P1：5′TTT CTG CAG AAGTCAGACATAACAGCAT  3′

P2：5′TTT GTC GAC TTCATCATCAGAAACTC    3′

扩增大豆胰蛋白酶抑制剂基因KTi基因片段；

用引物：

P1：5′TTT GTC GAC ATCCACATTTGGGACAGC   3′

P2：5′GGG TCT AGA TGGCAAATTGGAAGAAAA   3′

扩增大豆凝集素SBA基因片段；

提取大豆吉农17的基因组DNA，以其为模板，用引物：

P1：5′GGG GAA TTC TGCTTGGATTTGGACCAGAC  3′；

P2：5′GGG TCT AGA TAGGATATTGAACTAGTTCT  3′；

扩增大豆种子特异性启动子7αP；

提取AHLG的质粒DNA，以其为模板，用引物：

P1：5′TTT CTG CAG ATG GTG AGC AAG GGC GA  3′；

P2：5′GGG AGA TCT TTACTTGTACAGCTCGTC      3′；

进行GFP基因的PCR扩增；

将上述各基因分别插入克隆载体pMD18-T中；

2)克隆质粒pMD-T-7αP和表达质粒pCAMBIA3301分别用EcoR I、Xba I进行双酶切，电泳分离酶切片段，分别回收目的基因片段和载体大片段，16℃连接过夜，得到种子特异性表达载体p3301-7αP；

3)将重组质粒p3301-7αP经Pst I、Bgl II酶切，分离载体大片段；克隆质粒pMD18-T-GFP经Pst I和Bgl II酶切，分离目的基因片段，用T4DNA连接酶连接到重组质粒p3301-7αP上，得中间表达载体p3301-7αP-GFP；

4)同时用Pst I和Sal I、Sal I和Xba I分别双酶切克隆载体pMD18-T-KTi和pMD18-T-SBA，反应结束后，进行电泳，回收，连接，对KTi和SBA做T4连接，以连接产物为模板，用引物：

P1：5′GGG AGA TCT GTC AGA CAT AAC AGC AT 3′(Bgl II)

P2：5′TTG GGT TACC TGGCAAATTGGAAGAAAA 3′(BstE II)

进行扩增，得到的片段连入pMD18-T载体，得到重组克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ；

5)同时用Bgl II和BstE II分别双酶切克隆载体pMD18-T-KTiZ-SBAZ和过渡载体p3301-7αP-GFP，将切下的片段连入p3301-7αP-GFP，构建成正义表达载体pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ；

6)同时用Xba I和Pst I分别双酶切表达质粒pCAMBIA3301-KTiZ-SBAZ和克隆质粒pMD18-KTiZ-SBAZ，经电泳回收连接，得到双价RNAi表达载体pCAMBIA3301-7αP-SBAF-KTiF-GFP-KTiZ-SBAZ，统称：pCAMBIA3301-KTi-SBA。