[发明专利]一种人血小板源性生长因子A同源二聚体及其生成方法

权利要求书

1.一种生产人血小板源性生长因子A同源二聚体的方法，其特征在于：主要包括以下步骤：

(1)克隆人PDGF-A基因：以人血小板细胞提取总mRNA为模板，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整人重组PDGF-A基因片段，所用PDGF-A特异引物中引入Xho I酶切位点和在未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pMD20-T载体，得质粒rhPDGF-A/pMD20-T，经过测序确定为正确表达序列；

(2)构建真核表达载体：将表达载体pPICZαA和质粒rhPDGF-A/pMD20-T经过Xho I及Xba I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZαA/PDGF-A；

(3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZαA/PDGF-A用SacI单酶切线性化后，用电击转化法转入毕赤酵母GS-115宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

(4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500μg/mL Zeocin的YPD平板，筛选到了Zeocin抗性的转化子；将所述Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基洗下，经稀释后，涂布到2000μg/mL Zeocin的YPD平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基培养至光密度值＞10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0％，诱导120小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rhPDGF-AA酵母转化子；

(5)诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH 8.0透析后，利用CM阳离子交换柱于ATKA-HPLC系统中纯化，0.13MNaCl的20mM Tris pH 8.0缓冲液漂洗后，利用PBS洗脱收集的样品，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，浓缩样品经分子筛分离，收集OD₂₈₀＞50mAU的样品；收集的样品利用超滤方法浓缩，浓缩样品经分子筛分离，收集PDGF-AA目标蛋白，最后得到纯度达97％以上的重组人PDGF-AA蛋白。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征是：步骤(1)中所述PDGF-A特异引物为：

5’-GCCTCGAGAAGAGAAGCATCGAGGAAGCT-G3’

5’-GCTCTAGATCACCTCACATCCGTGTC-3’。

3.根据权利要求1或2所述方法生产得到的人血小板源性生长因子A同源二聚体，该同源二聚体中一条PDGF-A链经糖基化修饰，另一条链未经糖基化修饰；所述同源二聚体的分子量27825.513Da。