[发明专利]一种快速简便的基因克隆方法

权利要求书

1.一种快速简便的基因克隆方法，其特征在于首先利用快速限制性内切酶系统酶切载体DNA或目的DNA，酶切体系如下：

载体或目的DNA           5～20ng或5～20ul

10×酶切缓冲液            2.5μl

内切酶1                  1.5μl

内切酶2                  1.5μl

双蒸水              补足至25μl

然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸钠沉淀DNA的方法来回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀体系如下：

载体酶切产物抽提上清             20μl

基因片段酶切产物抽提上清         20μl

乙酸钠                            4μl

冷乙醇                           80μl

进而离心沉淀得到目的DNA和载体DNA酶切产物的混合物，室温干燥后进行连接，其连接体系如下：

沉淀                     0μl

5×连接缓冲液            2.0μl

连接酶                   0.5μl

双蒸水              补足至10μl

最后，连接产物转化大肠杆菌，第二天用菌落PCR方法筛选阳性克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

第1、通过PCR获得目的DNA片段并选择好目的载体；

第2、取载体DNA和PCR产物分别进行快速的限制性内切酶反应，酶切完成后分别加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1的混合液，然后涡旋混匀进行抽提；

第3、将第2步抽提得到的上清取出置于一个新的离心管中混合，再加入pH5.2的乙酸钠和冷乙醇沉淀酶切后的DNA，混匀后置于-20℃或者-70℃放置半个小时，然后离心去上清，于室温晾干DNA沉淀，加入适量的去离子水溶解DNA，再加入连接缓冲液和DNA连接酶，然后继续后面的连接、转化和筛选步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法用于各种基因克隆或者亚克隆实验的中间步骤。