[发明专利]一种表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌

权利要求书

1.一种表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于它是导入了来源于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的蔗糖磷酸化酶SPase基因的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述工程菌的基因型为F^-ompT gal dcm lon hsd SB(rB^-mB^-)，所述工程菌含有表达载体pET-Spase，其中，所述表达载体pET-Spase是在质粒pET-22b(+)中多克隆位点插入了蔗糖磷酸化酶SPase基因。

3.根据权利要求1所述表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述的菌株分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli)sp1515，已于2011年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2011010。

4.权利要求1所述的表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于它包括如下步骤：

(1)提取肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291总DNA；

(2)设计引物，用PCR方法克隆SPase基因，引物在5’端加上GCTCTAGA序列构成Xba I酶切位点，在5’端加上CCCAAGCT构成Hind III酶切位点；

上游引物5’-GCTCTAGACGCAATCGTTACAGTTATTACTAGC-3’；

下游引物5’-CCCAAGCTTGTTCTGAGTCAAATTATCACTGCTC-3’；

(3)将上述重组后的SPase基因插入到质粒pET-22b(+)中，得重组载体pET-Spase；

(4)然后将重组载体pET-Spase转入大肠杆菌，进行重组克隆筛选，获得大肠杆菌工程菌。

5.权利要求1所述的表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌工程菌在制备蔗糖磷酸化酶中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于将大肠杆菌工程菌经诱导培养后，细胞破碎，得到的粗酶液经亲和层析分离纯化制得蔗糖磷酸化酶。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的诱导培养方法如下：将大肠杆菌工程菌于37℃下过夜培养，按体积比3～5％接种于LB培养基，当OD＝0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.1～1.1mmol/L，在20～40℃、200rpm的条件下诱导培养4～16h，离心获得菌体。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的诱导培养方法如下：将大肠杆菌工程菌于37℃下过夜培养，按体积比3～5％接种于合成培养基，当OD＝0.6～0.8时，加入乳清粉和甘油至终浓度分别为5～20g/L和5～15g/L，在20～40℃、200rpm的条件下诱导培养6～24h，离心获得菌体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的合成培养基包含如下组分：NaH₂PO₄·2H₂O 4.0g/L，K₂HPO₄14.6g/L，NH₄Cl 0.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5g/L，(NH₄)₂-H-citrate 1.0g/L，Na₂SO₄ 2.0g/L，微量元素2ml/L，MgSO₄ 120g/L，硫胺素0.34g/mL，葡萄糖1g/L和氨苄青霉素0.1g/L；其中，所述的微量元素含有如下组分：CaCl₂·6H₂O 0.74g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.18g/L，MnSO₄·H₂O 0.1g/L，Na₂-EDTA 20.1g/L，FeCl₃·6H₂O 16.7g/L，CuSO₄0.1g/L，CoCl₂0.104g/L。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的亲和层析方法为使用HisSepharose HP凝胶柱进行亲和层析。