[发明专利]IL-24-Tat PTD融合蛋白及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种IL-24-Tat PTD融合蛋白，它是由IL-24与小肽两部分所组成的融合蛋白，小肽位于IL-24的碳末端，其特征在于：所说小肽是Tat PTD，由11氨基酸组成，序列为YGRKKRRQRRR。

2.一种权利要求1的IL-24-Tat PTD融合蛋白的构建方法，其特征在于由下述步骤组成：

(1)携带IL-24融合蛋白基因的构建

采用聚合酶链式反应以人IL-24基因为模板扩增获得IL-24融合蛋白基因，将所扩增的该基因产物经质量分数为1.0％的琼脂糖电泳回片后与pGEM-T easy载体连接，将连接产物转化感受态的DH5α细胞，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，获得阳性克隆为带有IL-24融合蛋白基因的质粒载体；

(2)IL-24-Tat PTD融合蛋白基因的原核表达

将携带IL-24融合蛋白基因的载体通过ClaI和SpeI酶切并回收片段，与经同样酶切处理的原核表达载体pGEX4-3-6His连接，连接产物转化感受态细胞，经酶切鉴定获得阳性克隆，即为携带IL-24融合蛋白基因的原核表达载体；

将携带IL-24融合蛋白基因的原核表达载体转化大肠杆菌BL21，经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达目的蛋白，经Ni柱纯化后获得IL-24融合蛋白；

检测蛋白含量，并进行SDS-PAGE检测纯化的蛋白；

(3)IL-24融合蛋白基因腺病毒载体的制备

带有IL-24-Tat PTD融合蛋白的pGEMT/IL-24-Tat PTD载体经ClaI与SpeI双酶切后回收目的片段，然后与经ClaI与SpeI双酶切的腺病毒E1穿梭载体pacAd5 CMV K-N pA连接后转化获得阳性克隆，经酶切鉴定获得阳性克隆即为IL-24融合蛋白基因的腺病毒穿梭载体，所获得阳性克隆载体经XhoI与NotI双酶切后获得片段，与经SalI与NotI双酶切后的pAd5-E4-PGK-miniCMV-eGFP-Fiber-RGD载体连接后转化感受态细胞，经酶切鉴定得到阳性克隆即为携带IL-24融合蛋白基因用于腺病毒载体E4修饰的穿梭载体；

将用于腺病毒载体E4修饰的携带IL-24融合蛋白基因的穿梭载体经XhoI线性化后与经SwaI酶切线性化后的pCRAd5-backbone在大肠杆菌BJ5183中同源重组获得阳性克隆即为携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒载体；

将PacI线性化的携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒载体转染HEK293细胞，7～10天收获病毒原液，经过进一步扩增及CsCl纯化获得携带IL-24融合蛋白基因的腺病毒。

3.权利要求1IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗宫颈癌药物中的用途。

4.权利要求1IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗肺癌药物中的用途。

5.权利要求1IL-24-Tat PTD融合蛋白在制备治疗恶性黑色素瘤药物中的用途。