[发明专利]一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中高效表达载体，及其构建方法。

背景技术

据世界粮农组织统计，截至2010年世界饥饿人口已超过10亿，随着人口增长和畜牧业的发展，人畜争粮矛盾也日渐突出，同时畜牧业的高速发展也给世界带来了严重的环境问题。在这种情况下，寻找开发新的饲料资源，提高现有饲料资源的利用效率就显的尤为重要。纤维素和半纤维素是一种可再生自然资源，在自然界中含量极为丰富。因此充分开发纤维素和半纤维素，可有效拓展我国饲料资源开发范围，同时减缓人畜争粮的矛盾。

木聚糖(Xylan)是植物半纤维素的主要成分，谷物饲料中存在的木聚糖是阻碍营养物质消化的抗营养因子，它使饲料消化利用率大大降低，影响畜禽的生长发育。木聚糖是一种多聚五碳糖，主要成分是D-木糖，它与纤维素、果胶等结合在一起形成复杂的超分子结构，仅靠自然条件的单一酶类很难降解利用它。目前人们通过化学法和生物酶法来对木聚糖进行降解，虽然化学方法的降解效率比起自然降解的效率有所提高，但是这种方法操作复杂，降解成本高，污染环境的同时也会危害到操作者自身的健康。因此现阶段人们经常用采用生物酶法来降解木聚糖，利用的主要生物酶是木聚糖的专属水解酶-木聚糖酶。

木聚糖酶是一类将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合水解酶系，其中β-1，4-D-木聚糖酶负责水解木聚糖主链骨架，是酶系中的关键酶。这种酶在提高饲料转化率、发酵成产乙醇、纸浆漂白等众多领域有着十分重要的应用价值。利用基因工程的方法改造木聚糖酶基因、优化分泌表达系统从而获得优良的酶工程菌具有重要的工业生产意义。

在木聚糖酶基因克隆表达中常使用大肠杆菌作为分泌和表达宿主，具有遗传背景清楚、表达周期短、转化效率高、操作简单等优点，因此也是目前掌握最为成熟的表达系统。但是大肠杆菌也有其自身的不足之处：它的表达蛋白易形成包涵体，不利于下游的纯化加工，同时木聚糖酶的表达蛋白无法分泌至胞外，也为酶活测定和直接利用带来麻烦。枯草芽孢杆菌则是继大肠杆菌后又一广泛使用的表达系统，它与大肠杆菌一样遗传背景清楚，培养简单，易操作，但同时它没有致病性，并且可以经由信号肽引导将表达蛋白分泌至培养基中，表达产物多数具有天然构象和生物活性，弥补了大肠杆菌表达系统的不足。

枯草芽孢杆菌具有很强的向胞外分泌蛋白(中性蛋白酶A和B、碱性蛋白酶、枯草多肽酶F、α-淀粉酶)的能力，蛋白分泌主要通过Sec途径，其次是Tat途径。其中大多数细菌分泌蛋白都通过Sec转运系统分泌。

Sec途径又叫普通分泌途径，目前大部分文献报道中外源表达蛋白均通过Sec途径分泌，枯草芽孢杆菌的分泌蛋白约有300种(Manting EH etal.2000)，几乎所有分泌蛋白都是经由Sec途径转移分泌至胞外。Sec转运系统包括信号肽、信号肽酶、SecYEG通道以及各种细胞因子，其中SecA、SecD、SecE、SecF、SecY、ffh、ftsY编码蛋白参与整个转运过程。SecA是ATP酶，通过水解ATP提供分泌蛋白前体穿膜的驱动力，SecE、SecY和SecG组成蛋白转移极性通道-SecYEG，SecD和SecF则是蛋白转移酶的辅助成分。

在Sec途径中，核糖体首先合成分泌蛋白前体，该分泌蛋白前体带有分泌蛋白的标记-信号肽，蛋白处于未折叠状态。随后Sec蛋白(SecA)的ATP酶活性水解ATP和质子原动力，分泌蛋白前体在信号肽的引导下，通过细胞膜上的极性通道转移至细胞膜外，通道蛋白由一组膜蛋白组成，负责定位和转移分泌蛋白的细胞质(周冰和张惟材2004)，在整个转移过程中分泌蛋白体以肽链形式存在。穿过细胞膜之后，信号肽酶切除信号肽，蛋白质正确折叠并穿过细胞壁被释放至培养基中。由此过程可以看出信号肽是引导外源蛋白跨膜分泌的关键元件。

信号肽是引导蛋白质穿过细胞膜的一段连续的氨基酸序列。一般由10-40个左右的氨基酸残基构成，它包括三个区域：氨基端区、疏水端区和羧基端区。氨基端区的N端由带正电荷的氨基酸组成，又称为碱性氨基末端或N端，常见的氨基酸有赖氨酸和精氨酸。疏水端区由20个或20个以上的中性氨基酸组成，在与膜脂接触时形成α螺旋结构，常见氨基酸有亮氨酸、异亮氨酸等，又称为H端；羧基端区的C端含有小分子氨基酸，主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等，含有信号肽酶的切割位点，亦称加工区或C端。其中疏水区的长度和疏水性在分泌中起着重要的作用。