[发明专利]一种检测脑组织中异常朊蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫检测方法，更具体地说，涉及一种检测脑组织中异常朊蛋白的方法。

背景技术

朊病毒(prion)疾病是一组累及中枢神经系统的致死性脑病，包括人类Creutzfeldt-Jakob病(CJD)，Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征(GSS)，致死性家族失眠症(fatal familial insomnia，FFI)和kuru病；在动物主要有瘙痒病和牛海绵状脑病(疯牛病)。人类CJD发病可呈散发性、家族性和获得性，这类疾病潜伏期长，往往在老年期发病，但近来在英国出现的新型变异型CJD却常见于年轻患者。新型变异型CJD具有传染性，其发病可能与食用动物病变组织有关，它的出现引起了世界范围的广泛关注。

朊病毒疾病的显著标志是在患者脑组织中出现一种异常的朊蛋白，即PrP^Sc。它的编码基因与在正常脑组织中存在的PrP^C相同，但具有明显不同理化特性。PrP^Sc具有抵抗蛋白酶水解特性，可在脑组织中形成淀粉样堆积，因而又称之为PrP^res。目前各国科学家面临的最大挑战是阐明在朊病毒病发病过程中正常的PrP^C如何转变为致病的PrP^Sc。由于尚未发现有任何一种蛋白在结构改变后获得致病性和传染性，这一难题的解决将会在生物学和医学领域内产生一次革命。朊病毒病的临床表现缺乏特征性，有效的实验室诊断方法的建立将有助于朊病毒病的确诊。

目前国外各国已广泛采用世界卫生组织推荐的CJD及其亚型的诊断标准。这一标准在参考临床征象、脑电图和影响学改变的基础上，着重强调使用实验室检测技术。这包括对病人脑组织中PrP-res蛋白的检测，常规病理学改变，脑脊液14-3-3蛋白的检测、PrP基因序列的检测等。CJD病例的确诊必须通过严格的实验室诊断，对于动物源性传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy，TSE)的确诊也同样依赖于有效的实验室检测。动物TSE对人类公共卫生的威胁已经得到了广泛的认可，但目前对肉类及肉制品、动物血清制品等常用物品仍缺乏快速准确的检测方法。随着基因工程药物、疫苗，转基因动物药物及产品的研制和使用，对TSE因子的检测问题就显得更为重要。

我国对CJD病人的诊断仍多停留于临床资料、脑电图改变，仅有2-3个实验室采用实验室诊断技术，并且所用检测抗体均来自国外。所以，亟需制备出高特异性、高灵敏度的抗朊蛋白抗体，并在此基础上发展一种能够准确、灵敏地检测CJD患者脑组织中异常朊蛋白的方法。

发明内容

本发明提供了一种检测脑组织中异常朊蛋白的方法。

简而言之，我们从人血白细胞中获得朊蛋白脱氧核糖核酸(DNA)，并利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统在大肠杆菌中成功的表达了C端朊蛋白，经亲和纯化后免疫家兔，制备朊蛋白特异抗体，然后用于检测脑组织中异常朊蛋白的检测。

本发明的检测方法部分建立在本发明人制备获得了高特异性的抗朊蛋白抗体。

我们利用GST融合蛋白表达系统成功地表达了C端朊蛋白，其表达产量高，同时具有良好的免疫反应性，表达蛋白经纯化后，用作免疫原免疫家兔，制备了高效价抗C端朊蛋白多克隆抗体，表明表达的C端朊蛋白具有良好的免疫原性。

第一个方面，本发明成功克隆了朊蛋白的编码基因

我们根据该基因公开的核苷酸序列，设计合成了一对朊蛋白特异引物。用朊蛋白特异引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，在约750碱基对(base pair，bp)处有一扩增条带。扩增带纯化后，与克隆载体(pGEM-T)连接构成重组质粒(pT-PrP)，DNA序列测定证实，插入片段序列与文献报道一致，确系朊蛋白基因，氨基酸不变外，其余均与文献报道一致。以此为基础扩增出C端朊蛋白基因。

在本发明的实施方案中，所述朊蛋白特异引物的序列为：

上游引物：5’-GGA TCC ATG AAG AAG CGG CCA AAG CCT GG-3’

C端上游引物：5’-GGATCC ATG GGT CAA GGA GGT GGC ACC CAC-3’

下游引物：5‘-GAA TTC TCA TGG ATC TTC TTC CGT CGT AGT-3’