[发明专利]一种里氏木霉蛋白酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种里氏木霉蛋白酶，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者具有SEQ ID NO.1所示序列80％同源性以上的氨基酸序列。

2.一种用于构建权利要求1所述里氏木霉蛋白酶表达质粒的引物，其特征在于，其序列为：

上游：5’-CAACCGCGGACTGCGCATCATGGCCAGCCTTCGCCT-3’(如SEQ ID NO：2所示)或其互补链；

下游：5’-ATGCTCGAGTTAA GCACTGTTCCCGTTGAAG-3’(如SEQ ID NO：3所示)或其互补链。

3.一种如权利要求1所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)里氏木霉基因扩增；

2)里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建；

3)里氏木霉的转化与蛋白酶高产菌株的筛选。

4.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：设计SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其互补链为引物，以里氏木霉基因组DNA为模板进行PCR扩增。

5.如权利要求4所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为95℃预变性5min；94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；最后72℃延伸5min。

6.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：将步骤1)所得的PCR产物由Sac II和XhoI限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶分离，纯化回收连接，然后通过T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α通透细胞，通过分析筛选提取质粒，完成里氏木霉蛋白酶表达质粒的构建。

7.如权利要求3所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，步骤3)具体为：首先，用EcoRI降解步骤2)构建的质粒形成质粒片段，采用化学转化方法将该质粒片段转入里氏木霉RUT C-30宿主细胞；然后在含有潮霉素B的PDA培养基上培养，再将生长旺盛的菌落接种置PDA培养基上，通过生长和发芽，将绿色孢子再转移到新鲜PDA培养基上，以分离纯化转代稳定的转化子，将这些转化子的孢子接种在木霉纤维素酶诱导培养液，在三角瓶中培养后，采样离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳分析，同时上清液用偶氮酪蛋白作底物测定蛋白酶活力。

8.如权利要求7所述的里氏木霉蛋白酶的制备方法，其特征在于，所述木霉纤维素酶诱导培养液的pH值为4.8，用乳糖作为诱导物。

9.一种如权利要求1所述的里氏木霉蛋白酶在啤酒糖化中的应用。