[发明专利]一株高丁醇比贝氏梭菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株高丁醇比和高溶剂产量的贝氏梭菌，以及其在溶剂发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领域。

背景技术

丁醇作为优良的有机溶剂和重要的化工原料，已广泛应用于化工、塑料、有机合成、油漆等工业领域；同时，作为新一代的液体能源，丁醇正在被越来越多的国家重视，其具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。

由于世界经济的高速发展，石油消耗量快速增长，石油价格持续攀升，丁醇价格长期高位徘徊，古老的丁醇发酵技术，作为一种有效的、利用生物质资源生产重要平台化合物及燃料的生物转化技术，又开始重新被人们重视。丁醇生物发酵一般是利用丙酮丁醇梭菌或贝氏梭菌在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，简称AB或ABE。而传统法生产溶剂，丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6∶3∶1，同时还伴随着副产物乙酸和丁酸，释放H₂和CO₂，导致底物的转化利用率仅在35％左右。因此，提高ABE中丁醇的含量，并有效改善底物的转化率成为近年来丁醇发酵的热点问题之

近年来，国内外对丙酮丁醇发酵的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、基因工程改造、溶剂提取等方面进行。中国专利申请ZL200810032581.1报道了通过化学诱变处理丙酮丁醇梭杆菌，总溶剂产量在22g/L左右，丁醇比在73％左右；美国专利US2005/0089979A1报道了利用gas-stripping和连续发酵耦合来生产丙酮丁醇，在1L发酵罐中，以葡萄糖为底物，丁醇比停留在60～70％之间；1996年，上海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高产丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018(中国专利ZL95111733.5)，最终发酵产溶剂比为B∶A∶E＝7∶2∶1；O.Mutschlechner(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000，2：101～105)等利用贝氏梭菌NRRLB592，通过两阶段调控的方法连续发酵产溶剂，在稳定期丁醇比例的平均值为61％，溶剂产率平均值为0.25。

可见，提高溶剂中的丁醇比例在丙酮-丁醇发酵工业中，起着至关重要的作用，而利用菌种改良是提高丁醇比，增强发酵竞争力的关键手段之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一株高丁醇比贝氏梭菌，使其发酵的丁醇比高、总溶剂产量高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述高丁醇比贝氏梭菌的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株高丁醇比贝氏梭菌，其分类命名为贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M 2010309。

本发明所述的高丁醇比贝氏梭菌Clostridium beijerinckii ART124的筛选方法，将贝氏梭菌出发菌株NCIMB 8052(购于美国菌种保藏中心(ATCC))经等离子体诱变后，利用刃天青平板筛选得到还原力强的菌株，再经厌氧瓶发酵筛选获得丁醇比高和总溶剂产量高的丙酮丁醇梭菌目标菌株。

其具体步骤如下：

a)等离子体诱变：将贝氏梭菌原始菌株活化培养，培养温度33～37℃，25mL的肖特厌氧瓶装液量为10～15mL，培养时间12～16h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至OD₆₀₀＝0.1～1.0，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80～120W作为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～1800s作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变；

b)刃天青平板初筛：将诱变后的载片置于装有1～2mL生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含刃天青(0.002％)的培养基平板上，33～37℃厌氧培养12～36h，挑选出变色圈明显大于出发菌的菌落；

c)刃天青平板复筛：将步骤b)筛选的菌株接种于25mL的肖特厌氧瓶装液量10mL，充氮气3min，33～37℃厌氧培养10～14h，无菌生理盐水制成浓度OD＝0.1的菌悬液，吸取2μL点滴到含有刃天青(0.002％)的常规固体培养基平板上，在33～37℃温度下厌氧培养12～24h，挑选出透明圈明显大于出发菌的菌落；