[发明专利]具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素单加氧酶及其基因；该酶可以应用于含多环芳烃废水处理或土壤的生物修复。

背景技术

细胞色素P450是一类含血红素的单加氧酶，催化反应的典型机制是通过电子传递链，将分子氧还原，并将其中的一个氧原子加到底物中，反应过程中需要NAD(P)H作为电子供体。P450可以催化许多不同结构物质的羟基化、环氧化、脱烷基化、脱氨、脱氢、脱卤素等反应。P450家族中来源不同的成员具有广泛的底物谱，既包括生理过程中的多种甾醇和脂类，也包括许多外源化合物如染料、农药、多环芳烃、多氯联苯、杂环化合物等。因此，可以应用P450处理难降解化合物转化为其他生物易利用物质，结合常规生物除污手段，从而更有效的去除环境污染物。人类合成的化合物，大多数都能作为P450的底物，这使得P450在环境污染的生物修复中具有广阔的应用前景。

目前废水中的难降解物质主要是一些苯环类和杂环类物质，主要由于苯环类物质疏水性强，难以到达大部分酶的底物中心，导致了其难以被常规的生物处理手段降解。细胞色素P450可以使化合物的C-H键断裂，在C原子上加入一个O原子，使底物羟基化，从而提高疏水性化合物的水溶性，使其可以进入其他的一些氧化酶、过氧化物酶的催化中心，从而达到彻底降解苯环和杂环类物质的目的。

为了提高此类酶在降解多环芳烃类物质中的应用，因而期望寻找新型的能更好的降解多环芳烃的细胞色素P450单加氧酶。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶，其具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列。此外，还包括所示核苷酸序列的突变形式，所述突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。所述核苷酸序列编码的多肽具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

本发明的有益效果是，本发明涉及Bacillus pumilus的具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶基因的分离及表达。该基因对于制备用于生产具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶有用。另外，本发明还提供了具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶活性的多肽的氨基酸序列及功能等同体。同时，本发明还提供了制备，分离，纯化具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶活性的多肽的方法。

具体实施方式

本发明一方面提供一种能编码具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶多肽的核苷酸序列。所说的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2中的氨基酸序列的多肽或所述多肽的修饰形式，该修饰形式功能上相当或与细胞色素P450单加氧酶相关。核苷酸序列具有SEQ ID NO.1的多核苷酸序列以及它的突变形式，突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

本发明另一方面提供了一种具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶活性的多肽。该多肽具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

生产具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶的方法为：

1、分离出编码细胞色素P450单加氧酶的核苷酸序列SEQ ID NO.1：

2、构建含SEQ ID NO.1核苷酸序列的表达载体；

3、将步骤2中表达载体转入宿主细胞，形成能生产细胞色素P450单加氧酶的重组细胞：

4、培养步骤3中的重组细胞；

5、分离、纯化得到具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶。

首先，本发明提供了分离的，编码具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶活性多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Bacillus pumilus中分离到的，具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，它编码具有1047个氨基酸的多肽，推测分子量为119.21 kDa。

本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的分离的核苷酸分子，以及包含有重组载体的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组载体和宿主细胞的方法，以及用重组工程技术生产具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶的方法。

本发明进一步地提供了一种分离的具有多环芳烃羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶或多肽，其特征在于具有SEQ ID NO.2氨基酸序列，或至少70%相似，更佳地，至少具有90%，95%，99%的相同。