[发明专利]耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲酸脱氢酶，尤其涉及一种耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽和制备方法。

背景技术

甲酸脱氢酶 (formate dehydrogenase，FDH，EC1. 2. 1. 2) 催化甲酸生成CO₂和H₂O，同时将NAD⁺还原为NADH。细菌来源的NAD⁺依赖型甲酸脱氢酶由2个相同的亚基组成，对甲酸和NAD⁺具有高度的专一性。甲酸脱氢酶主要应用于辅酶NADH的酶耦联法再生系统中。甲酸/甲酸脱氢酶再生体系具有以下优点：1) 作为再生底物的甲酸价格低廉；2) 甲酸脱氢酶来源分布较广，在细菌、真菌、植物中均有分布；3) 甲酸脱氢酶的催化产物CO₂易于从体系中去除，不会干扰目标产物的分离；4) 反应体系中低浓度甲酸不会影响其他酶活性。但是目前也存在着活性较低，热稳定性不好，酶价格昂贵等缺点，限制了其使用范围。工业界唯一一例大规模生产过程中用到甲酸脱氢酶的即是德国Degussa公司利用来源于Candida boidinii的FDH 生产 L-亮氨酸。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种耐热型甲酸脱氢酶基因及其编码的多肽和制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种耐热型甲酸脱氢酶基因，它具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列以及它的突变形式，所述突变类型包括：缺失、无义、插入、错义。

一种上述耐热型甲酸脱氢酶基因编码的多肽，它具有SEQ ID No.2中的氨基酸序列。

本发明的有益效果是，本发明涉及Bacillus sp.的耐热型甲酸脱氢酶基因的分离及表达。以甲酸脱氢酶保守序列为基础，克隆分离了耐热型甲酸脱氢酶基因。该基因对于制备用于生产耐热型甲酸脱氢酶的转基因微生物或动植物，并回收获得该基因编码的酶有用。

Bacillus sp.保存于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号：CGMCC No.4271，分类命名：芽孢杆菌（Bacillus sp.）。

具体实施方式

首先，本发明提供了分离的，编码耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的多聚核苷酸分子，该核苷酸分子是从Bacillus sp.中分离到的，具有SEQ. ID NO.1的核苷酸序列，它编码具有401个氨基酸的多肽，推测分子量为44.07 kDa。

本发明还涉及一种重组载体，该载体包含本发明的分离的核苷酸分子，以及包含有重组载体的宿主细胞。同时，本发明包括构建该重组载体和宿主细胞的方法，以及用重组工程技术生产耐热型甲酸脱氢酶的方法。

本发明进一步地提供了一种分离的耐热型甲酸脱氢酶或多肽，具有SEQ. ID NO.2氨基酸序列，或至少70%相似，更佳地，至少具有90%，95%，99%的相同。

在本发明中，“分离的”DNA是指该DNA或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，“耐热型甲酸脱氢酶基因”指编码具有耐热型甲酸脱氢酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ. ID NO.1的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指该序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于公知的密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1核苷酸序列同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。

在本发明中，“分离的”蛋白的多肽是指其至少占样品总物质的至少20%，较佳地至少50%，更佳地至少80%，最佳地至少90%(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析，PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。分离的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组份。