[发明专利]一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及地表水体、污水的检测方法，具体涉及一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，该方法将多管发酵技术、PCR技术和最大可能数（MPN）计数方法相结合，能够准确的定量检测水中沙门氏菌活体的含量。适合于地表水体、污水等多种水样中沙门氏菌活体的定量检测。

背景技术

前对于沙门氏菌的检测，可以分为培养法、免疫学检测法和核酸检测法三类。培养法和免疫学检测法通常是根据沙门氏菌的生长特性，采用选择性的培养基使沙门氏菌成为优势菌群，然后基于沙门氏菌的生化特性和菌体表面抗原特性，利用生化反应和抗原-抗体反应的特异性进行沙门氏菌的检测。这些方法大都存在操作复杂、易受干扰、难以定量检测的问题。沙门氏菌属种类极多，其性状在水环境中时常会出现变异，常常出现实际生化反应结果与沙门氏菌鉴别表中的类型不相符的情况，造成检测失败。核酸检测法是利用PCR技术对沙门氏菌保守的基因片段进行检测来实现准确检测的目的，然而其最大的弊端是无法区分活体和已死亡的菌体，单纯利用PCR技术无法深入研究水环境中沙门氏菌对人体健康的影响。因此，目前还没有一种适用于水中沙门氏菌活体的定量检测方法。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：

步骤一，样品采集：

用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测；

步骤二，水样的浓缩：

对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤1000mL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2三种稀释度的样品；

对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10^-0、10^-1和10^-2稀释度的样品；

步骤三，水样前增菌：

将10^-0、10^-1和10^-2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；

步骤四，选择性增菌：

将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100 mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；

步骤五，平板划线分离：

挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；

步骤六，阳性菌落的鉴定：

培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp；并对PCR产物在100V下电泳40min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；

所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中：

上游引物139的序列为：5'- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'；

下游引物141的序列为：5'- TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3'；

步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量（MPN/100mL）。

所述的PCR扩增的条件是：

（1）PCR反应体系总体积25μL，其中各成分终浓度为：引物139和引物141各0.4μmol/L，0.75U Taq酶，0.8 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/L MgCl₂；