[发明专利]谷氨酸脱羧酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，简称GABA），由谷氨酸（Glutamic acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase, 简称GAD）催化脱羧而来。γ-氨基丁酸是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质。具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效。

目前利用基因工程技术过量表达谷氨酸脱羧酶基因，来进一步提高GABA的产量的研究已有相关报道。在这个研究领域中，主要是将这些来源于GABA积累菌株的谷氨酸脱羧酶基因导入到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的某个野生型菌株中，并使谷氨酸脱羧酶在宿主菌中得到高效表达，从而增强宿主菌生产GABA的能力，但是采用该方法生产GABA，需要加入大量L-谷氨酸或L-谷氨酸钠作为前体物质，而L-谷氨酸或L-谷氨酸钠通常由谷氨酸棒杆菌发酵产生。因此，现有技术生产GABA的过程复杂且生产成本高。

发明内容

本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadB2，该基因是根据基因组全序列已公布的短乳杆菌 ATCC 367的谷氨酸脱羧酶基因为参照设计引物，以筛选出的短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367的基因组为模板，利用PCR技术将其基因组中编码谷氨酸脱羧酶的基因gadB2扩增出来，并进行基因测序，其核苷酸序列如Seq ID NO .1。

本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadCB2，该基因除了含有谷氨酸脱羧酶的基因gadB2外，还含有与gadB2相连的编码谷氨酸/γ-氨基丁酸反向转运蛋白的基因gadC，其核苷酸序列如Seq ID NO .2。

本发明还提供了一种谷氨酸脱羧酶基因gadRCB2，该基因除了含有谷氨酸脱羧酶的基因gadCB2外，还含有与gadCB2相连的编码正转录调控蛋白的gadR基因，其核苷酸序列如Seq ID NO .3。

所述谷氨酸脱羧酶基因gadB2、gadCB2、gadRCB2均来源于短乳杆菌CCTCC NO： M 2010367。

所述短乳杆菌CCTCC NO：M 2010367为从本实验室系列乳酸菌中利用纸层析方法筛选出一株产γ-氨基丁酸的乳酸菌，已于2010年12月27日，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2010367，分类学命名：短乳杆菌Lb85(Lactobacillus brevis Lb85)。

为构建GABA生产菌株，将gadB2、gadCB2、gadRCB2基因分别连接到载体上，构建出三种谷氨酸脱羧酶重组表达质粒pDXW8-gadB2、pDXW8-gadCB2、pDXW8-gadRCB2；将三种重组质粒通过电转化的方法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，得到三株重组谷氨酸棒杆菌pDXW8-gadB2/ATCC13032、pDXW8-gadCB2/ATCC13032和pDXW8-gadRCB2/ATCC13032。

所述表达载体为大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体pDXW-8（专利申请号200910233618.1）。

所述谷氨酸棒杆菌 ATCC13032购自ATCC，该菌株具有积累谷氨酸的能力。

发酵液中GABA的精确定量：氨基酸自动分析仪法。用5%三氯乙酸将发酵液稀释25倍后静止30min，12000rpm离心10min沉淀蛋白，取上清液，用日立L835-50型氨基酸自动分析仪检测。氨基酸自动分析仪采用 2619#树脂（阳离子交换柱f2.6×150mm），53℃分析，GABA用外标法定量。

本发明将来源于野生菌的谷氨酸脱羧酶基因导入谷氨酸棒杆菌中，构建了谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌株以葡萄糖作为碳源、尿素等无机氮作为氮源，相对于需要外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠为前体物质的生物转化，生产成本明显降低。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

材料和试剂：