[发明专利]鹅源免疫球蛋白轻链Igλ全基因序列及克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种扩增鹅免疫球蛋白轻链Igλ基因序列及可变区基因序列的方法。

背景技术

随着基因工程技术的不断发展，抗体及其受体基因的探索，为基因工程抗体技术抗体制剂的研究和开发提供依据和基础。上世纪80年代中期出现的PCR技术，促进了基因工程抗体技术的突破性进展。人源化抗体、嵌合抗体、小分子抗体如Fab，Scfv，轻、重链抗体等基因工程抗体在生物医学等领域发挥越来越大的作用。

鹅被认为是人类所驯化的第一种家禽，有研究者根据线粒体DNA控制区序列、细胞色素b基因等差异比对证明，中国东北家鹅来自于鸿雁，种属于Animaiia动物界，Phylnm Arthropoda节肢动物门，Class Aves鸟纲，Order Anseriformes雁形目，Family Anatidae鸭科，Genus anser雁属，Anser cygnoides鸿雁。生物全基因组序列的揭示是一项具有重大意义的工程，但目前物种的全基因序列的禽类除鸡的全基因组的测知外，其它物种的研究并不十分清楚。基因工程抗体制备的关键前提就是获取抗体可变区的基因序列。目前，对人、鼠、鸡(莱航鸡)的抗体基因序列研究报道较多。关于水禽的基因研究尚少有报道。

近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR技术、RACE克隆策略已被广泛用于生物克隆领域。目前对小鼠的抗体基因研究较多。Orlandi最早系统地分析了小鼠抗体可变区(V区)基因序列，设计出正反方向的通用引物，扩增出完整的可变区基因，在真核细胞中表达。根据小鼠轻链区基因5′及3′端相对保守的特点，设计相应的引物通过反转录来扩增轻链的相应功能区。目前，根据5′端引物配对的位置不同，扩增鼠抗体可变区基因的简并引物设计主要分两种：一种是利用抗体轻链V区5′端引物与V区的前导序列互补，轻链V区3′端引物与K链C_L5′端和轻链V区的所有J段3′段互补；另一种利用与抗体可变区基因骨架区FR1和FR4互补的序列。上述第一种引物的简并性基本不会造成产物与原基因序列的差异，但由于前导序列变化较大，引物设计难度很高，往往得不到所需的扩增产物。而第二种引物因为其简并性，有可能造成抗体氨基酸的变异或缺失，这种差异可能会导致构建的嵌合抗体的亲和力等功能的降低。由于目前抗体基因库的资料有限，因此这些比较常见的引物可能还不适用于扩增一些特殊单抗的基因。鉴于此，近年来出现的RACE技术即cDNA末端快速扩增法具有省时、灵敏和高效的特点。RACE(rapid amplification cDNAend)。5′RACE是以PCR技术为基础，使用Oligo(Td)对mRNA进行反转录后，再用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)给cDNA的5′端进行同聚物加尾反应，从而在未知的cDNA的5′端加上一段linker，然后再用基因特异引物和引物经PCR扩增未知mRNA的5′端。采用5′RACE的方法可以得抗体的可变区及信号肽的真实序列，继而保证通过基因工程改造得到的抗体的功能。由于兼并引物在克隆抗体基因过程中会出现可变区两侧的抗体框架结构基因序列的改变，而使之不能确定，甚至会在基因表达时引起转录的移位。所以有必要在克隆鹅源免疫球蛋白轻链可变区基因的基础上，探索克隆全部轻链基因的成熟方法，通过采用RACE克隆的策略，鹅脾脏淋巴细胞获得一条鹅免疫球蛋白轻链Igλ全基因序列。

有报道，在进行抗体可变区基因的克隆，会不可避免地使扩增出的可变区的N、C末端不能完全等同于原序列，某些氨基酸残基的改变可影响基因工程抗体表达及其结合活性。而从前导序列扩增虽然能够得到N端的原序列，由于前导序列变化较大，所以引物设计的难度大，往往扩增效果不理想。采用RACE克隆策略，引物具有通用性，能得到完全与亲本抗体一致的基因序列，会提高抗体的亲和力，有助于抗体的表达。

基因工程抗体作为一种新型生物制剂在疫病的预防、诊断和治疗方面已显示出重要的作用。因此，本领域迫切需要开发操作简便、成本低廉、效果优异的扩增鹅抗体基因序列尤其是抗体可变区的方法及产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一条鹅免疫球蛋白轻链Igλ的全基因序列。另一目的在于提供一种获得鹅轻链Igλ基因，所述方法操作简便，效果理想。

本发明的第一方面，提供一种用于扩增鹅抗体轻链Igλ基因序列，所述的序列为鹅免疫球蛋白轻链Igλ基因。

第二方面，提供获得鹅轻链Igλ全基因序列的方法，所述方法包括：

1、鹅脾脏淋巴细胞全RNA的提取