[发明专利]一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要是一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列。

背景技术

随着生活水平的提高，消化道肿瘤的发病率呈逐年上升趋势，位于恶性肿瘤首位，亦是全球癌症导致死亡的主要原因，且总体仍处于姑息治疗水平。胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，也是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一。根据世界卫生组织公布的全球统计报告，世界胃癌年发病率为13.86％/10万人，仅次于肺癌居第二位。我国是胃癌的高发区，每年新发现40万胃癌患者，占世界胃癌发病人数的42％，而且发病率呈年轻化趋势，近5年来，19岁至35岁青年人胃癌发病率比30年前翻了一番，由上世纪70年代的1.7％上升至3.3％。

目前胃癌治疗以手术、放疗和化疗为首选方法。手术的最大优点是快捷了当地切除肿瘤，解决机体当前的致命伤，对局部治疗效果极佳；缺点是对全身治疗与机体防御反应的提高毫无作用。放疗对胃癌的敏感性低、疗效差，加之胃部周围重要脏器多，放射治疗常伤及机体的正常细胞和组织。化疗的优点是全身治疗并且对癌细胞的杀伤力强，对原发的、残留的、扩散的或转移的肿瘤细胞，均有独到与回生之功，但缺点是毒副作用大，使全身遭受到某种程度的损害。

对早期胃癌，手术切除治疗效果较好，但由于胃癌初期常无显著症状，缺乏临床特征，多数患者检查发现时已是较晚期，超出了根治切除范围。化疗往往使患者忍受不了它的副作用，甚至使患者的生存质量日趋恶化，因此，手术切除配合靶向性强的抗肿瘤中药治疗具很大应用前景。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白及其基因序列，一种对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质及其编码的基因序列，雷丸蛋白酶基因工程菌的构建。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：

本发明所提供的对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白(对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质)，其基因序列为序列表中序列1所示的核苷酸序列(其基因序列为SEQ ID No：1)，命名为LAtP。

所述对胃肿瘤细胞有特异性作用的雷丸蛋白(对胃肿瘤细胞具靶向作用的雷丸蛋白质)，其氨基酸序列为序列表中序列2所示的氨基酸序列(其氨基酸序列为SEQ ID No：2)，命名为LAtP。

由SEQ ID No：1核苷酸碱基序列被其他碱基所取代但氨基酸残基序列不变的蛋白质均在本发明保护范围之内。

由SEQ ID No：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对胃肿瘤细胞具有靶向作用的由(a)衍生的蛋白质均在本发明保护范围之内。

所述雷丸蛋白对胃肿瘤细胞有特异性作用可由以下方法阐明：

(1)提取纯化对胃肿瘤细胞有特异作用的雷丸蛋白

本发明所用提取液：15％pH 8.0的1MTris-HCl，2％的聚乙烯吡咯烷酮K30，25％的甘油。

研磨雷丸成粉末，按3.5mL/克样品加入上述提取液，低温静置4h。离心取上清，以SephadexG50为介质，以pH8的Tris-HCl盐酸洗脱，检测波长280nm下收集吸收峰，聚乙二醇(PEG)20000浓缩主峰。

(2)正常胃细胞和胃肿瘤细胞实验

以DMEM(含100U·mL^-1青霉素和100pg·mL^-1的链霉素)培养液培养正常胃细胞MC-1和胃癌细胞MC-4，以RPMI1640(含100U·mL^-1青霉素和100pg·mL^-1的链霉素)培养液培养胃癌细胞SGC-7901，培养条件均为37℃、5％CO₂。

以相应细胞培养液稀释雷丸蛋白至180μg/mL、120μg/mL、90μg/mL、60μg/mL和45μg/mL，分别加于37℃、5％CO₂中培养24h后的3种细胞中，同样条件下培养18h，0.25％胰酶消化细胞、收集，磷酸缓冲液(PBS)清洗两次，将细胞悬浮于100μL binding buffer(Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit I，BD Pharmingen公司)中，加入5μl Annexin V FITC及5μlPI染色液，轻轻混匀，避光室温孵育15min，加入400μL Binding buffer，流式细胞仪检测。

所述对胃肿瘤细胞有特异作用的雷丸蛋白的基因序列和体外表达可由以下方法获得：

(1)雷丸蛋白LAtP的N-端测序