[发明专利]枯草芽孢杆菌菌种及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种枯草芽孢杆菌菌种，同时还涉及该枯草芽孢杆菌菌种在实现细菌型豆豉纯种发酵方面的应用。

背景技术

豆豉主要以黑豆、黄豆为原料，利用微生物发酵而成的一种调味食品，其营养丰富、特有的豉香和鲜味，一直以来在豆制品中占有特殊的地位，成为独具特色的调味品和家常菜肴，深受消费者的欢迎。按发酵时参与的微生物不同，豆豉可分为毛霉型、曲霉型、根霉型和细菌型等；按发酵时是否加食盐，分为咸豉和淡豉；按成品含水量多少，分为干豉、湿豉和水豉。我国主要生产毛霉型、曲霉型豆豉及细菌型豆豉(俗称水豆豉)。

在细菌型豆豉生产过程中，一直沿用传统的自然发酵方法进行生产，发酵过程中经常出现杂菌污染，产气、顶盖、二次污染和生产周期不稳定等现象，易产生毒素，这些因素成为制约企业生产发展的瓶颈。细菌型豆豉之所以至今没有实现纯种发酵，是因为豆豉在自然发酵过程中，芽孢杆菌、微球菌、乳酸菌和酵母菌等多种微生物共同作用，产生大量的复合酶分解大豆，从而得到风味优良的豆豉。单一纯种发酵通常只适宜生产生化反应简单、成分单一、纯度较高和无风味要求的产品，不能满足生产营养丰富和风味要求较高的传统发酵食品。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种适宜工业纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌种。

本发明的另一目的在于提供该枯草芽孢杆菌菌种在在豆豉发酵生产中的用途。

一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH3519，其形态特征：RH3519属芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌。生长曲线显示：0-3h为延滞期；4-15h为对数生长期；15-19h为生长稳定期；19h以后为衰亡期。菌落形态特征：菌体宽0.96μm，菌体长4.73μm；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间或稍偏；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；菌落形态不规则，表面干燥、不透明，浅褐色，容易挑起。不利用大豆中的糖类物质发酵产气。适宜生长温度在32℃-42℃之间。

该菌种已于2010年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京中国科学院微生物研究所)，保藏号：CGMCC NO：4255，名称为：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH3519。

(一)枯草芽孢杆菌菌种的分离步骤：

活化出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MTJQ2(已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏)和纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto CICC：10023)，枯草芽孢杆菌MTJQ2在对数生长期加入量为10U·mL^-1青霉素，甘氨酸加入2g·mL^-1。纳豆芽孢杆菌在对数生长期青霉素的适宜加入量为40U·mL^-1，甘氨酸加入2g·mL^-1。完全培养基培养2h后收集菌体，使菌含量在1.0-1.5×10⁸个·mL^-1。MTJQ2对溶菌酶比较敏感，形成原生质体的最佳条件为：酶浓度0.05mg·mL^-1，35℃酶解5min。纳豆芽孢杆菌形成原生质体的最佳条件为：酶浓度0.50mg·mL^-1，35℃酶解20min。原生质体悬液涂布于再生培养基上，用枯草芽孢杆菌MTJQ2的原生质体与纳豆芽孢杆菌的原生质体进行融合，稀释涂布于再生培养基上再生，挑取原生质体融合菌株发酵大豆后依据感官鉴定进行筛选。

(二)菌种的培养：

完全培养基：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g、水1000mL，pH7.0。固体培养基加琼脂20g，121℃灭菌20min。

再生培养基：LB完全培养基加入0.5mol·L^-1甘露醇，0.02mol·L^-1MgCl₂·6H₂O，121℃灭菌20min。

(三)保种和传代：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加水至1000mL。用5NNaOH调pH 7.0-7.2。

LB培养基：酵母抽提物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水至1000mL，5mol·L^-1NaOH调pH7.0-7.2。

以上为液体培养基。固体培养基需按2％添加琼脂，121℃灭菌20min，冷却至45-50℃时倒入培养皿中即可。