[发明专利]艾滋病病毒和梅毒螺旋体融合蛋白及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明公开一种艾滋病病毒和梅毒螺旋体融合蛋白及其制备方法，还进一步提供GICA一步双联快速检测艾滋和梅毒抗体试纸条及制备方法，可同时快速检测艾滋和梅毒抗体，适用于现场快速检测和流行病学调查，属于免疫学检测领域。

背景技术

艾滋和梅毒（以下简称：HIV和TP）是严重危害公共健康的传染病，两种病传播途径均为性传播，母婴传播，血液传播。近年来，艾滋病和梅毒的发病率都呈现上升趋势，尽早检出病例，对于及时就医、及时控制可起到积极的作用。

胶体金免疫层析技术(Gold Immuno-Chromatographic Assay,GICA) 是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的一种新型的固相标记免疫检测技术，在生物性、医学检验领域得到了日益广泛的应用，具有简便、快速、不需任何仪器设备、成本低廉、保存时间长等优点，在微生物检测领域具有巨大的发展潜力。

现在已有的商品化的胶体金试纸条是对艾滋或梅毒抗体分别检测，操作费时而不方便，且绝大部分是进口试剂，合计检测成本较高，目前尚没有一步双联快速检测艾滋和梅毒抗体试纸条的报道。

发明内容

本发明目的是提供一种艾滋病病毒和梅毒螺旋体融合蛋白及制备方法，用于制备同时检测艾滋和梅毒的试剂产品。

本发明还公开了一种GICA一步双联快速检测艾滋和梅毒抗体试纸，能够同时联合检测艾滋和梅毒病毒。

本发明所提供艾滋病病毒和梅毒螺旋体融合蛋白，具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

HIV融合蛋白氨基酸残基序列：序列表中的SEQ ID №：1；

TP融合蛋白氨基酸残基序列：序列表中的SEQ ID №：2。

将序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的蛋白质。

本发明所提供艾滋病病毒和梅毒螺旋体融合蛋白的制备，包括主要优势抗原原核表达载体的构建、主要优势抗原的表达、鉴定与纯化；

本发明所提供的制备HIV和TP基因工程重组抗原的免疫胶体金探针方法包括胶体金制备、胶体金溶液的最佳pH确定、最适标记抗原量的确定和HIV和TP基因工程重组抗原的免疫胶体金探针制备及纯化。

所提供的GICA一步双联快速检测艾滋和梅毒抗体试纸，由样品处理垫、金标结合物垫、硝酸纤维素膜、吸水纸垫和垫板五部分组成。玻璃纤维素膜制备的样品处理垫紧密连接于含有HIV和TP基因工程重组抗原的免疫胶体金探针的金标结合物垫；所述金标垫紧密连接于硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上设有一条测试带和一条对照带，测试带上含有含有HIV和TP基因工程重组抗原，对照带上含有抗含有HIV和TP基因工程重组抗原的抗体；所述硝酸纤维素膜紧密连接于吸水材料制备的吸水纸垫；上述试纸紧密连接于一垫板；上述带有垫板的试纸按所需大小切割，转入塑料层析盒，该层析盒对应于样品垫处设有点样口，对应于测试带和对照带的部位设有观测窗，即为GICA一步双联快速检测艾滋和梅毒抗体试纸，加干燥剂后密封包存。

本发明所提供的制备HIV和TP基因工程重组抗原的方法，包括以下步骤：

1）主要优势抗原原核表达载体的构建

查找相关文献，选择艾滋病病毒和梅毒螺旋体2种病原体的主要优势抗原表位，并确定其核苷酸序列，设计特异PCR引物，通过PCR扩增，获得含有目的抗原基因的片段，将目的片段插入原核表达质粒，并转化到适宜的感受态细胞中，经ABI核酸自动测序分析仪进行序列分析重组是否正确。

HIV融合蛋白基因DNA序列：序列表中的SEQ ID №：1；

TP融合蛋白核苷酸序列：序列表中的SEQ ID №：2。

2）主要优势抗原的表达与鉴定

挑选经测序分析重组正确的阳性单菌落，经过对表达条件进行优化（主要是诱导表达时间的优化），接种于具有抗性的LB培养液培养，经IPTG诱导蛋白表达，收集菌体用SDS-PAGE和Western blot鉴定主要优势抗原的表达。

3）主要优势抗原的纯化

按照INVITROGEN公司镍离子亲和纯化操作手册对目的蛋白进行纯化，4℃保存备用。

本发明所提供的制备HIV和TP基因工程重组抗原的免疫胶体金探针方法包括以下步骤：

1）胶体金制备　参考柠檬酸三钠还原法和微波技术，通过电子显微镜观察，确定制备40 nm胶体金颗粒的氯化金与柠檬酸三钠的最佳比例。