[发明专利]长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA合成领域，具体涉及一种长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法。

背景技术

1970年Agarwal等人花费了20人年合成75碱基对(base pair, 简称bp) （ K. L. Agarwal, H. Buchi, M. H. Caruthers, N. Gupta, H. G. Khorana, K. Kleppe, A. Kumar, E. Ohtsuka, U. L. Rajbhandary, J. H. V. de Sande, V. Sgaramella, H. We- ber, and T. Yamada. Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast. Nature, 227(5253):27–34, Jul 1970）。如今随着化学合成技术的进步，DNA合成公司可以以相对合理的时间和费用合成上千碱基对序列。然而当前的合成技术主要还是依靠人力完成，且错误率随着合成序列的长度迅速上升。传统的分子生物学方法依赖于自然DNA模板的存在，通过设计适当的引物进行PCR反应得到需要的DNA片段，而后将这些片段用ligation反应拼接在一起，但是这种传统方法不适用于无模板的合成DNA。近年来麻省理工学院提出了BioBrick方法，即将常用的DNA片段置于预先定义好的一组酶切位点中(所谓的BioBrick)，每次要将两个BiroBrick用限制内切酶切开再拼合，但是会在两个BioBrick中间产生一个scar（伤痕），可以想见对于长链DNA这种方法会产生大量的伤痕，从而造成不可预测的表型影响。所以长链无模板DNA(>10,000base pair)的合成仍然是当今合成技术的难点。

发明内容

为了解决现有长链无模板DNA合成中存在的技术问题，本发明提供了一种以自动移液工作站为核心的方法，可以在极少的人工干预下进行对乃至真核基因组(>10000,000 base pair)的DNA序列进行自动化合成。由于该自动化合成中心仅需要最小化的人工干预，整个合成过程在无菌条件下进行，极大程度的减少了对样品的污染。其次自动化移液站可以非常精准的提取和释放定量的试剂，避免了人工操作的引入的误差，使得成功率大大提高。该自动化合成中心的操作速度大大超过了人工操作，而且可以无休全速工作，使得生产效率上升，同时通过减少误差减少人力和时间，达到了大片段DNA的高通量高保真自动化合成和合成成本的大幅下降。

     本发明所说的长链无模板DNA的高通量高保真自动化合成方法，包括以下步骤：

（1）用户指定需要合成的DNA序列；

（2）系统通过运行内置的计算机辅助设计程序对DNA序列进行分析计算。该计算机程序将长链DNA分隔成多个750碱基(bp)大小的生物组件(Building block)，相邻两个生物组件之间有一定的重叠序列(一般60－75bp)。这些生物部件最终可以拼接成用户指定的合成DNA序列。计算机程序进一步将每个生物组件分隔成16－20个有一定重叠的长度为60－79bp的单链核苷酸。这些单链核苷酸已经有成熟且价格合理的合成方法，可以从多种来源获得，或者可以自己合成。（通过进行多次聚合酶链反应（PCR）可以将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，并且在每次聚合酶链反应后进行长度检测（可以通过凝胶电泳或者bioanalyzer等方式）。最后将这些生物组件拼成目的合成DNA序列；

（3）计算机程序最终输出机器代码用于操作自动化移液站。经过编程，该自动化移液站可以精确无误的将单链核苷酸进行混合，并添加定量的反应酶及各种试剂，而后进行聚合酶链反应，质粒转座和后续的质量监控步骤；

（4）通过进行多次聚合酶链反应（PCR）可以将这些核苷酸精确构成双链的生物组件，并且在每次聚合酶链反应后进行长度检测（可以通过凝胶电泳或者bioanalyzer等方式）。在生物组件合成之后，将进行DNA分析保证每个碱基都是正确的。最后自动化中心将挑选正确的生物组件，最终拼装成目的合成DNA送交用户。