[发明专利]一种液体纤维二糖酶的发酵生产方法

说明书

技术领域

本发明属于酶的制取技术领域，是一种液体纤维二糖酶的发酵生产方法。

背景技术

生物质乙醇的研发是当前各国新资源战略的重点。世界各国，尤其是巴西、美国、加拿大、德国、瑞典、日本等发达国家，都已致力于开发清洁高效的生物质能利用技术，但目前世界上还没有一家工业规模利用生物质原料生产燃料乙醇的企业。酶成本过高，纤维素向酵母可利用单糖的转化效率偏低已成为该行业发展的瓶颈。

纤维素是植物细胞壁中含量最丰富的多糖，占生物质原料干重的50一60％，是地球上最丰富、最廉价的可再生能源。纤维素分子是有许多吡喃型的D-葡萄糖残基以β-1,4糖苷键相连而成的多糖，是一种高分子化合物，分子内部通过氢键的缔合作用形成纤维素束，使其不易水解；而纤维乙醇的生产需将纤维素水解为葡萄糖以供发酵之用；因而对其水解酶类的研究备受关注。纤维素酶是将纤维素水解为葡萄糖的一组酶的总称，包括1,4-β-D－葡聚糖水解酶、1,4-β-D－葡聚糖纤维二糖水解酶和β－葡萄糖苷酶等组分在内的起协同作用的多组分酶系。液体发酵往往使得所得酶系单一，水解不够彻底；而固体发酵虽可得到较为完整的酶系，但相对于大规模生产，设备投资、占地面积、环境污染均较大，且极易染菌。若以液体发酵生产不同种类酶后混合使用即消除了固体发酵的弊端又便于扩大生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活高，成本低，易操作、发酵周期短、产品质量稳定，无毒无污染的液体纤维二糖酶的发酵生产方法。

实现本发明的目的所采取的技术方案是：液体纤维二糖酶的发酵生产方法包括以下步骤：

（1）菌种：使用纤维二糖酶生产菌株中的黑曲霉菌株作为生产菌株，于PDA斜面保藏备用；

（2）菌种培养：挑取菌苔旺盛的步骤1斜面保藏备用的菌种放入培养瓶中，在28～32℃的温度条件下培养1～3天，移入装有培养基的种子罐中，移入的菌种量为培养基的1% ～6%，在28～32℃温度、通风比0.1～0.7v/v条件下培养12～36小时，制得生产发酵菌种；

（3）发酵处理：按以下重量百分比的比例制备成混合发酵浆料，

2～10%的发酵菌种，

2～8%粉碎粒度0.8mm 以下的玉米芯，

0.5～1.5%的玉米浆，

0.3～1%的营养盐，

其余为水；

将发酵浆料放入发酵罐中，通风量0.1～0.7v/v、搅拌转速100～350rpm进行通风搅拌发酵，并在发酵20～30h后每隔2～6小时按初始发酵浆料重量流加重量百分比为0.1～3%的玉米浆和重量百分比为0.1～1.0%的粉碎粒度0.8mm 以下的玉米芯，温度控制在26～34℃，发酵5～7天，经板框过滤滤去发酵浆液中的残渣即可制成液体纤维二糖酶。

其中步骤1中所述黑曲霉菌株，属于现有技术，可以从市场上购买得到。

其中步骤1中所述培养基中含有2～8%重量百分比浓度的玉米芯、0.5～1.0%重量百分比的玉米芯水混合液，其余为水。

其中步骤3中所述营养盐为：（NH4）₂SO₄ 6.0g/L，KH₂PO₄ 4.0 g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，Fe SO₄0.4mg/L，Zn SO₄·7H₂O 2.0mg/L，Cocl₂·6 H₂O2.0mg/L。

其中步骤3中所述残渣，可以作为饲料添加剂出售。

按照上述方法生产的液体纤维二糖酶，采用高产酶活的黑曲霉诱变株作为生产菌株，以玉米芯作为发酵基料，能够保证霉菌生长繁殖快，生产的纤维二糖酶无毒、无害，含有内切β-1,4葡萄糖甘酶等。该方法还具有生产工艺简单，操作实施方便，原料来源广泛，生产成本低，无污染等优点适宜于规模化工业生产。

本方法生产的液体纤维二糖酶既可应用于食品、能源、饲料以及环保等领域，更可用于生物乙醇，提高生物质原料向酵母可利用单糖的转化效率，从而提高生物质原料获得燃料乙醇的效率，有效解决规模化生产对酶量的需求，同时也有效提高了秸秆资源的综合利用水平。而且利用玉米芯作为低糖培养基，发酵得到酶制剂后分离出的固体残渣含有一定量的纤维二糖酶和菌体蛋白等营养物质，用作饲料添加剂效益明显。

具体实施方式