[发明专利]一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物生物技术、具体是一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法。

背景技术

水牛是我国南方主要大家畜之一，具有适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、使用年限长等生物学特性，非常适合我国南方农村饲养。开发利用水牛畜种资源，将现有的役用水牛转化为乳用或乳肉兼用的商品水牛，是水牛畜牧产业发展的趋势。然而目前水牛的繁殖率很低、种群的生产性能低劣，急需发展和完善一批与家畜遗传改良密切相关的农业高技术来提高水牛繁殖力和产奶量。利用胚胎工程技术，特别是转基因动物技术，是培育动物新品种以及培育动物抗病新品种的一条有效技术措施。2002年，人们首次将慢病毒载体法应用到转基因动物研究，并在猪、牛等多种动物取得了成功。慢病毒载体转基因具有以下优点：能感染分裂细胞和非分裂细胞；能转染多种组织，包括早期胚胎细胞；能稳定整合和长期表达外源目的基因；不易诱发宿主免疫反应；可兼容多个启动子等。这些优点使得慢病毒载体法成为转基因动物方法学上的一个新的突破。相对于其他物种来说，水牛体细胞和胚胎不易被外源基因感染，基因转染的效率较低，同时，外源目的基因不易稳定整合和长期表达；这为获得水牛转基因胚胎及生产转基因水牛增加了难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，以适应水牛品种改良的需要。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，包括如下步骤：

1、高滴度慢病毒包装：采用传代培养的293T细胞以及3质粒包装系统和磷酸钙转染方法进行慢病毒包装。转染前，将293T细胞以1×10⁵cells/mL的密度传代于经多聚赖氨酸处理的培养皿中，用10％DMEM培养液于体积百分比为5％CO₂的37℃培养箱中培养，生长到70～80％汇合度时备用。转染前1h，将培养基更换成无血清无双抗的DMEM。

转染时，将3个质粒即15μg载体质粒、10μg包膜蛋白质粒pΔ8.9、5μg包装质粒pVSV-G和125μLCaCL2于试管中混合均匀，补足体积至500μL。将500μL含磷酸氢二钠、pH值为6.95的转化液滴加入上述混合液中，室温静置30min。将质粒混合液逐滴加到100mm培养皿的293T细胞中，于体积百分比为5％CO₂的37℃培养箱中培养，第二天换正常培养液培养。转染后48～72h收集病毒。将收集的上清于1500rpm离心10min，0.45μm滤器过滤收集病毒原液。将病毒上清以20000rpm离心力、4℃离心2h，用100μL的PBS重悬得到浓缩慢病毒，-80℃冷冻保存。

病毒滴度的检测：293T细胞以浓度2×10⁵cells/mL接种于24孔板中，每孔加500μL DMEM培养液培养过夜。检测时将4μL病毒液加到500μL含2％FBS的DMEM培养液中混合均匀，换掉原有的培养液。48～72h观察绿色荧光蛋白表达情况并计数。

2、制作水牛转基因体细胞：传代培养4～5代的水牛成纤维细胞用慢病毒原液进行感染。感染细胞时，除用DMEM和10％胎牛血清外，加入0～10μg/ml polybrene。转染第2天，换正常培养液继续培养细胞并传代3次，在荧光显微镜下检测绿色荧光蛋白GFP表达情况。

3、制作水牛转基因嵌合胚胎：采用显微注射方法将浓缩慢病毒注入到水牛成熟卵母细胞透明带下或IVF受精卵中。

水牛卵母细胞体外受精后，将慢病毒浓缩液30～70pL注射到水牛IVF受精卵，与颗粒细胞的单层体外共培养7～9天后，在荧光显微镜下检测囊胚GFP表达情况，筛选获得水牛转基因嵌合胚胎。

4、转基因水牛生产：将经受精卵原核注射法生产的转基因阳性胚胎移植到自然发情或同期处理发情的代孕母牛子宫内中，一头母牛移植2枚胚胎。2个月后B超观察妊娠状况，对妊娠水牛继续跟踪观察10个月。

本发明突出的实质性效果：

采用本发明获得了高滴度慢病毒粒子，浓缩病毒平均滴度达到10⁹以上。将病毒原液直接感染水牛成纤维细胞，阳性细胞感染率可达30％以上。采用受精卵原核注射法将浓缩病毒注射到水牛成熟卵母细胞透明带下或IVF受精卵中，24％以上转基因胚胎发育至囊胚阶段，40％以上囊胚表达外源基因。成功获得一头转绿色荧光蛋白GFP基因的转基因水牛。

附图说明

图1是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛成纤维细胞的可见光图谱。

图2是用本发明方法获得的慢病毒感染的水牛成纤维细胞的紫外光图谱。