[发明专利]一种微流控单细胞活性氧自动分析仪

说明书

技术领域：

本发明涉及微流控分析平台技术，尤其涉及一种可以自动实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测的微流控单细胞活性氧自动分析仪。

背景技术：

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元。在细胞的代谢过程中会不断产生各种活性氧(ROS)，例如：超氧阴离子(O₂^-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟基自由基(OH·)、脂自由基(ROO·)、过氧亚硝基阴离子(ONOO^-)等。适当水平的活性氧对生物正常的生理过程是重要的，它们参与细胞信号转导、细胞生长调节、重要生物物质的合成及细胞代谢。当生物处于氧化胁迫、外源性药物或毒素刺激条件下，过量活性氧的产生并积累则会诱导一系列有害的细胞信号转导，导致机体产生各种疾病及老化。近几年细胞水平上活性氧的分析研究非常令人关注，但由于细胞尺度小(通常直径在μm级、体积在pL级)、胞内活性氧含量低(一般为amol～zmol级)、生化反应快(通常在ms级)，使得目前一些分析方法多是将各种活性氧作为一个整体获得的结果多是基于静态、宏观的观察和整体平均而推导出来的。因此，发展高选择性、高灵敏度、能同时识别和检测单个细胞内不同活性氧的仪器装置及分析方法，对于发现宏观检测所不能获得的宝贵信息，进一步阐明活性氧种类、水平与生物生理、病理的相互关系，乃至疾病的早期诊断具有十分重要的意义。

目前，用于细胞水平上活性氧分析的商品化仪器，主要有激光扫描共聚焦显微镜、扫描隧道显微镜和流式细胞仪。激光扫描共聚焦显微镜和扫描隧道显微镜的优点是：可以对细胞内活性氧进行原位、实时动态和空间上的观察与分析；其不足是：受其质量测限高、分辨力低等因素限制，难以定量检测单细胞内活性氧的含量。流式细胞仪作为半个世纪以来科学研究和工程技术不断进步的结晶，被广泛应用于生物、医学等领域。例如：美国Bekman-Coulter公司的Cytomics FC500流式细胞仪，其优点是：可以对直线流动的细胞进行快速分选和单细胞内多参数的测量。其不足是：由于其测量数据是与生物样本比较的相对值，抗体非特异性结合直接影响细胞阳性、阴性的界定，因此需要在使用前对系统进行方法校准或标定，存在操作繁琐、细胞耗量大、仪器体积庞大、价格昂贵等问题。

近年来，以微流控芯片为核心的微流控分析在核酸、蛋白质、小分子等方面的应用研究发展迅猛，并正在向单细胞、单分子等领域渗透。与传统的宏观研究体系相比，微流控芯片作为单细胞研究平台具有以下优势：1)芯片通道尺寸(通常10-100μm)与典型晡乳类细胞的直径大小(一般为10-40μm)相匹配，便于细胞操纵；2)芯片通道的二维或三维网络式封闭结构，便于形成与细胞生理状态相接近的特定空间环境；3)芯片的平板式几何构型，容易对细胞进行观察、检测；4)芯片通道尺寸的减小，降低了细胞试样与试剂的消耗，同时可使分析速度成十倍、百倍地提高，便于实现高通量分析；5)将各种细胞操纵单元与电泳分离、检测技术组合，便于实现细胞内、尤其是单个细胞内多种化学组分的分离与定性、定量分析。迄今为止，已开展的微流控芯片细胞研究工作，其绝大部分集中在细胞培养、细胞分选、体外细胞微环境模拟、细胞生命过程鉴定等。少量报道的微流控单细胞组分分析是一种创新性尝试，其单个目标细胞的获得(即单细胞捕获)仍需要借助显微镜等观察装置，存在手工操作、速度慢、检测灵敏度低、装置复杂等问题。微流控单细胞组分分析通常包括：单细胞进样(细胞上样、单细胞捕获)、溶膜、电泳分离及胞内组分检测等操作步骤。目前，微流控单细胞组分分析所面临的主要技术问题是：1)缺少有效操纵单细胞的手段；2)缺少自动获知单个目标细胞已被捕获的适配技术；3)检测灵敏度有待进一步提高；4)缺少自动实现整个分析过程的仪器联用技术。对于微流控单细胞活性氧分析来讲，新型荧光探针及其装载方法的发展，为单细胞内活性氧的特异性识别与荧光检测奠定了基础。然而，由于受上述技术瓶颈和芯片上细胞活性氧标记技术的限制，目前还没有出现能够检测单个细胞内活性氧的微流控分析仪器。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，提供了一种微流控单细胞活性氧自动分析仪。利用本发明可以实现微流控芯片上细胞荧光标记、细胞上样、单细胞捕获、溶膜、电泳分离和胞内活性氧检测等操作，达到无需借助显微境以及手工操作即可自动实现单细胞内活性氧分析的目的。

本发明的目的可通过如下技术措施来实现：