[发明专利]荠菜冷诱导COR15a基因启动子及其在植物的抗寒性改良中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物、植物基因工程技术领域，具体涉及植物逆境诱导启动子的克隆及其应用。

背景技术

植物对环境变迁及不良环境有足够的适应性和抵抗能力，这种抗逆性既受系统进化的遗传基因型控制，又受个体发育中的生理生态因素制约。温度作为重要的环境因子之一，限制植物的分布及生长和产量，对植物生长发育起着决定性作用（Viswanathan C, Zhu JK. Molecular genetic analysis of cold-regulated gene transcription. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002, 357(1423):877-886）。随着转基因技术的日益成熟，人们已从植物中分离了大批抗寒相关基因（蔺忠龙,李维薇,白现广,吕广磊,程在全. 植物抗冻基因最新研究进展, 北方园艺, 2009(1):ll9- 123）用于抗寒植物的培育。但利用抗寒相关基因进行转基因抗寒植物培育时均发现在获得优良低温抗性植株的同时，普遍出现不同程度的生长延滞（retardation）现象。主要是利用抗寒相关基因进行的转基因植物都是在组成性启动子CaMV（cauliflower mosaic virus）35S驱动下产生的。这种基因的组成性表达对植物的生长造成了一定的影响。为了克服转基因植物出现的生长延滞现象，人们开始利用冷诱导特异性启动子代替组成性启动子。冷诱导基因RD29A（来源于拟南芥COR78基因）启动子驱动的转基因植株的研究表明，转基因植株的生长延滞比CaMV35S启动子驱动的转基因植株所表现出来要轻微得多（Kasuga M, Miura S, Shinozaki K. A combination of the Arabidopsis DREB1A gene an d stress-inducible RD29A promoter improved drought and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Ph siol, 2004, 45:346-350）。利用特异性的诱导型启动子避免外源基因在宿主植物中非特异性的持续、高效表达已经得到广泛共识，但是真正能应用于生产实际的特异性启动子不多，而冷诱导型特异启动子更少。目前特异启动子的克隆及其结构功能的研究是转基因植物研究中的一个热点，也是一个生发点。这一领域的研究成果将极大推动转基因植物基础研究的进展，加速转基因植物的产业化。

荠菜（Capsella bursa-pastoris）是一种1或2年野生的草本植物，平铺地面，喜阴，在南方是处处可见的一种可食用的蔬菜，属于十字花科、荠菜属Capsella Medik，在低温条件下能够正常生长发育并结实。早期的研究表明，在拟南芥中COR基因在低温诱导表达下被启动，能够促进细胞产生抗冷力，在植物的抗冷作用中起作用，其中COR15a基因的功能研究最深入，在其抗旱作用中起30%。构建的一种表达 COR15a多肽的转基因型，耐冻性比野生型的植株有显著提高（Artus NN, Uemura M, Steponkus PL, Gilmour SJ, Lin C, Thomashow MF. Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thaliana COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:13404-13409）。本发明所涉及的荠菜冷调节基因CbCOR15a基因的启动子是从荠菜叶片的DNA中克隆到的。目前尚未发现荠菜CbCOR15a基因启动子序列和利用荠菜冷调节基因CbCOR15a基因启动子用于培育耐寒植物的相关报道。

发明内容

本发明的目的是克隆、鉴定一个低温强烈诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗寒相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗寒性，最终获得抗（耐）寒能力明显增强的优良植物品种。

本发明通过以下技术方案实现：