[发明专利]一种新的顺丁烯二酸异构酶及应用

权利要求书

1.一种新的顺丁烯二酸异构酶，其特征在于：包括

采用分子生物学技术方法，对人工全合成的SEQ NO.1基因序列5’端进行缺失，得到包含具有如SEQ NO.2序列的工程菌，发酵得到可溶性异构酶蛋白，并用于底物异构化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在不改变阅读框架的前提下，SEQ NO.1基因序列5’端的缺失范围在126-234bp，即Δ(126-234)SEQ NO.1。

3.根据权利要求1所述的顺丁烯二酸异构酶的应用，其特征在于：制备步骤3.1所述的可溶性酶蛋白的方法包括：

3.1用PCR方法或全基因合成方法得到如SEQ NO.2的基因序列；

3.2构建含有SEQ NO.2的基因序列的重组质粒，并将重组质粒导入大肠杆菌，得到基因工程发酵菌种；

3.3将发酵菌种接种于含氨苄青霉素100μg/mL的适宜体积的LB培养基中，在摇床上250rpm，37℃下培养至A₆₀₀1.0左右，再接种到适宜的发酵培养基中，控制pH、溶氧和温度，30℃培养至A₆₀₀5.0左右，加入适量诱导物诱导，同前培养3～9小时，在5～15℃、6000rpm条件下离心收集细菌，备用。

3.4将2.3获得的菌体全细胞或破菌后溶液加入到体积和浓度适宜的马来酸溶液中，控制温度和pH，搅拌进行转化反应；也可以在2.3步骤诱导表达后的培养液中加入适宜的马来酸铵(钠)，控制温度和pH，搅拌进行转化反应。

4.根据权利要求1所述的工程菌构建，表达载体是pET21或pET32或其他合适的载体，宿主细胞为大肠杆菌BL21、Rosetta或Origami。

5.根据权利要求2所述的基因序列，采用现有的基因工程技术构建大肠杆菌基因工程菌；诱导物表达的诱导物可以是乳糖或IPTG，也可以是两者的混合物，诱导物IPTG浓度为0.05～1％，最适浓度为0.1％。

6.根据权利要求3所述的发酵方法，发酵培养基其特征在于：低糖高氮适于大肠杆菌生长。

7.根据权利要求3所述的转化方法，其特征在于：步骤3.4中的转化反应中顺丁烯二酸铵(钠)的投料比例按1L发酵液体积中加入100～400g的量计算，最适投料比例为1∶100(V/W)；控制温度在15～37℃下进行转化反应，最适温度为室温；控制pH在5.5～8.0，最适pH为6.0～7.2；搅拌转速以菌体细胞不发生沉积为妥，如破菌只需偶尔搅拌；转化反应可在24～48小时完成。

8.本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。