[发明专利]一种基因工程单链抗体检测伏马菌素B1的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的检测试剂盒，更具体地涉及了利用基因工程单链抗体检测伏马菌素B₁ (Fumonisin B₁, FB₁) 的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒检测FB₁的方法。

背景技术

伏马菌素是一种水溶性真菌毒素，在世界上的污染广泛存在，主要污染粮食作物及饲料，尤其对玉米及其制品污染严重。伏马菌素的热稳定性高，不易被破坏，对人畜具有神经毒性、肺毒性等多种毒性及致癌性，主要损伤肝脏和肾脏，严重危害人类和动物的健康。目前，用于免疫检测伏马菌素的抗体都是单克隆抗体。单克隆抗体的生产采用抗原免疫动物，然后利用免疫动物的脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，最后筛选出具有高抗体活性而又能大量繁殖的杂交瘤细胞。整个生产过程比较复杂，消耗的时间长、费用高，尤其是生产过程需要熟练的专业技术人员进行操作。

发明内容

为了克服现有单克隆抗体生产费时、费力、费钱的不足，本发明提供了一种基因工程单链抗体检测伏马菌素B₁的试剂盒及方法，使得伏马菌素B₁的检测过程简便易行，省时、省力、省钱，

本发明的技术方案如下：

本发明的利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的试剂盒，其试剂包括：

（1）样品提取液：去离子水；

（2）标准试剂：FB₁-KLH；

（3）酶标抗原试剂：为含FB₁-KLH-HRP 偶联蛋白的0.01M PBS溶液，保存于体积比为50%的甘油内，-20℃保存，效价为5000；使用时用PBS溶液稀释；

（4） 洗涤液：TNT溶液；配方组份：体积比为0.05％的吐温-20，20 mmol/L Tris－HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4；

（5）BSA试剂：含5% （重量比）BSA的TNT溶液；

（6）显色底物：10 ml显色液；配方组份： 250 μL 20 mg/mL DAB，40 μL 40 mg/mL NiCl，9.75 ml 的pH 6.8的1.0 mol/L Tris-HCl，-20℃保存；使用时加7 μL 30％（体积比）H₂O₂；

（7）终止液：去离子水中含：0．1 mol／L亚硫酸钠，2 mol／L硫酸。

使用上述利用基因工程单链抗体检测真菌毒素的试剂盒检测FB₁毒素的方法，依次包括以下步骤：

（1）样品处理：在1g样品中加入4ml样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取、离心，上清液即为含样品的提取液；

含样品的提取液取与酶标抗原试剂等体积混和均匀，即成A试剂；

           标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均匀，即成系列浓度的B试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用PBS溶液稀释（5毫升PBS溶液中加1μL酶标抗原试剂）；

（2）试剂平衡：将试剂盒平衡至室温；

（3）小孔编号：取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2－6号孔为FB₁毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗FB₁毒素单链抗体；

（4）洗涤：每孔内加入200～300μL洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置2min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；

（5）加样：1号孔加上50 μL BSA试剂，2－6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μL，样品孔加入相应的A试剂50 μL，轻轻震荡，使各孔混匀；

（6）反应：将反应板放入37 ℃恒温箱中孵育30 min；

（7）洗涤：取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200～300μL洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；

（8）显色：每孔加入显色底物100 μL，摇匀，将反应板放入37 ℃恒温箱中存放15 min；