[发明专利]一种快速提取血液总核糖核酸的方法有效
申请号: | 201110027557.0 | 申请日: | 2011-01-25 |
公开(公告)号: | CN102154264A | 公开(公告)日: | 2011-08-17 |
发明(设计)人: | 韩典霖;俞萍;李晓晨;孙克非 | 申请(专利权)人: | 天根生化科技(北京)有限公司 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10 |
代理公司: | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人: | 罗文群 |
地址: | 100192 北京市海淀区西*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 提取 血液 核糖核酸 方法 | ||
1.一种快速提取血液总核糖核酸的方法,其特征在于该方法包括以下各步骤:
(1)向100~400微升全血中加入快速红细胞裂解液,加入的体积比为:全血∶红细胞裂解液=1∶5,颠倒混匀8~10次,得到混合物;
(2)对上述混合物进行离心分离,离心分离的转速为7300转/分钟,离心分离时间为3分钟,取出离心分离的沉淀物;
(3)在上述沉淀物中加入240微升悬浮液,研磨至沉淀完全溶解,加入200微升裂解液,混匀,再加入20微升蛋白酶K溶液,充分颠倒混匀,55℃下放置10分钟,颠倒混匀,得到溶液;
(4)在上述溶液中加入240微升无水乙醇,混匀后转入硅膜吸附柱中,进行吸附离心,离心吸附的转速为12000转/分钟,离心吸附时间为1分钟,倒去废液;
(5)向步骤(4)的硅膜吸附柱中加入350微升去蛋白液,进行第一次去蛋白离心,去蛋白离心转速为12000转/分钟,去蛋白离心时间为15秒,倒去废液;
(6)向步骤(5)的硅膜吸附柱中加入活性单位为0.375Kunitz的脱氧核糖核酸酶溶液80微升,室温下放置15分钟后,再加入350微升去蛋白液,进行第二次去蛋白离心,去蛋白离心转速为12000转/分钟,去蛋白离心时间为15秒,倒去废液;
(7)向步骤(6)的硅膜吸附柱中加入500微升漂洗液,室温下静置2分钟,进行脱盐离心,脱盐离心的转速为12000转/分钟,脱盐离心时间为15秒,倒去废液;重复该步骤一次;
(8)对步骤(7)的硅膜吸附柱进行干燥离心,干燥离心的转速为12000转/分钟,干燥离心时间为2分钟,将吸附柱置于室温下2~5分钟,去除吸附材料中的漂洗液;
(9)在步骤(8)的硅膜吸附柱中加入30~50微升无核糖核酸酶的水,室温下放置2分钟后,进行洗脱离心,洗脱离心的转速为12000转/分钟,洗脱离心时间为2分钟,得到核糖核酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于其中所述的快速红细胞裂解液的各组分的质量为:
氯化铵 60~100克
碳酸氢钾 15~20克
乙二胺四乙酸四钠 6~8克
十六烷基三甲基硫酸铵 5~10克
将上述各组分称重后混合,加去离子水,得到混合液,用氢氧化钠溶液调混合液的pH值至7.2~7.4,并使混合液体积为1000毫升。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于其中所述的悬浮液的配方为:
酒石酸钠 11.5~17.25克
盐酸胍 573~764克
乙基苯基聚乙二醇 5~10毫升
将上述各组分量取后混合,加去离子水,并使混合液体积为1000毫升。
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