[发明专利]一种从霞水母刺丝囊毒素内分离致死毒素蛋白的方法

权利要求书

1.一种从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：

1)将霞水母刺丝囊细胞加入预冷缓冲液中破碎，破碎后2～6℃离心，收集上清液，待用；

2)将上述步骤1)上清液于2～6℃下用缓冲液透析过夜，然后低温离心，收集上清液，待用；

3)将步骤2)所得上清液过滤，而后用含Con A Sepharose 4B亲和柱进行分离，分离时采用含有0.1～0.3Mα-甲基-D-甘露糖苷和0.1～0.3MNaCl的pH7.4，浓度10～30mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，低温离心，收集上清液，待用；

4)将步骤3)得到的上清液用强阴离子交换树脂Mono Q预装柱纯化分离，依次采用pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl缓冲液和含1M NaCl的pH7.8，浓度为10～30mM的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.2～0.5mLmin^-1，收集约25～40min洗脱液，即为从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白。

2.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)霞水母刺丝囊细胞为：将置于-80～-20℃低温的霞水母触手于2～6℃自溶12～48h，自溶后利用20～60目的标准分样筛滤去触手残片，而后在2～6℃下10000～15000g离心5～20min，收集下部沉淀，2～6℃冷冻干燥，待用。

3.按权利要求1或2所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤1)向霞水母刺丝囊细胞加入pH7.8，浓度10～30mM的2～6℃下预冷Tris-HCl缓冲液中，而后将其置于冰浴下用超声波功率为200～400kw下破碎20～60min中，工作/间隙为5s/30s。

4.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2)离心条件为在2～6℃下，10000～15000g离心5～20min。

5.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤2)中缓冲液为含有1～3mM MnCl₂、1～3mM CaCl₂和0.1～0.3M NaCl的pH7.4，浓度10～30mM的Tris-HCl。

6.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3)中的过滤时将步骤2)收集的上清液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤。

7.按权利要求1所述的从霞水母刺丝囊毒素中分离致死毒素蛋白的方法，其特征在于：所述步骤3)中将步骤2)所得上清液过滤，而后用含ConA Sepharose 4B亲和柱进行分离，首先采用含1～3mM MnCl₂，1～3mM CaCl₂和0.1～0.3M NaCl的pH7.4，浓度10～30mM的Tris-HCl缓冲液洗掉未结合的蛋白，然后采用含0.1～0.3M α-甲基-D-甘露糖苷和0.1～0.3M NaCl的pH7.4，浓度10～30mM的Tris-HCl缓冲液进行洗脱并收集洗脱液，而后将收集的洗脱组分于2～6℃采用pH7.8，10～30mM Tris-HCl缓冲液透析，低温离心，收集上清液，待用。