[发明专利]嗜酸乳杆菌PCR检测、鉴定特异引物对

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体而言，提供了利用PCR技术快速检测、鉴定嗜酸乳杆菌的引物对，适合于微生物肥料质检机构、菌种鉴定机构应用。

背景技术

嗜酸乳杆菌是乳杆菌属中应用较广泛的菌种之一，具有降低胆固醇、抗肿瘤活性、延缓机体衰老、增强机体免疫力等多种保健功能。另外，嗜酸乳杆菌分泌的细菌素(LactacinA，LactacinB)能阻止其他微生物定植生长，拮抗致病菌和有害微生物生长以及毒素的分泌。目前嗜酸乳杆菌在微生物肥料领域也得到了广泛的关注，研究发现其在腐解有机物料及抑制病原菌等方面均具有良好的使用效果。

在微生物肥料产品中，以嗜酸乳杆菌作为生产菌株的产品越来越多；另一方面，在产品质量检测过程中发现，乳杆菌种类多，表型相似，很难快速准确区分，而传统的检测方法主要是以形态特征和各项生理生化方法为主，存在着检验周期长，操作繁琐，费用高，准确性差等缺点。因此，迫切需要研究建立快速、准确、灵敏的检测新方法，以满足以嗜酸乳杆菌为有效菌的微生物肥料产品检测的准确性和时效性。

PCR方法有着快速、准确和灵敏的特点，使用种特异引物对菌株进行特异PCR扩增用于微生物快速鉴定技术已经广泛用于食品安全、临床医学等领域：如对各种病毒和病源体-乙肝病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病源菌已建立了PCR检测方法；在微生物肥料领域也得到了应用，关大伟等人曾建立了的特异PCR法用于沼泽红假单胞菌的鉴定和检测，曹凤明等人建立了一种鉴定微生物肥料中侧孢短芽孢杆菌的特异PCR方法，都取得了良好的应用效果。这都表明了随着技术的发展，分子生物学技术将在微生物检测领域发挥着越来越重要的作用。为将PCR技术更广泛应用于微生物肥料检测和菌种鉴定领域，本发明人利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)，以Genbank数据库中某个嗜酸乳杆菌的gyrB基因(促旋酶基因)为目标模板序列设计出一对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)种特异性引物。并通过反复摸索实践建立了基于PCR技术的、能够快速、准确、灵敏地检测微生物肥料中嗜酸乳杆菌的方法。该方法适用于嗜酸乳杆菌的检测和鉴定。

发明内容

本发明内容的关键是提供用于检测、鉴定嗜酸乳杆菌的特异引物对。另一内容是提供利用这对引物对待测菌株进行特异PCR扩增鉴定嗜酸乳杆菌的方法。

具体而言，本发明利用已公布的嗜酸乳杆菌gyrB核酸序列为目标模板序列，利用NCBI中Primer-BLAST(引物设计和特异性检验工具)设计出一对嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)种特异性引物。通过优化PCR反应中的镁离子浓度和退火温度等条件来提高PCR方法的特异性，并根据优化结果建立了嗜酸乳杆菌的特异PCR鉴定方法，用于微生物肥料中嗜酸乳杆菌的检测和鉴定。

本发明用于检测、鉴定嗜酸乳杆菌的引物对序列为：

上游引物(F)：5′-AGTTGGTACGGTGCCGCTTGA-3′；

下游引物(R)：5′-TCCAGCTTCGTGCATCCCACC-3′。

本发明用于鉴定嗜酸乳杆菌的PCR方法为：

PCR反应体系：10×buffer             2.0μL

Mg²⁺(25mmol/L)         1.6μL

dNTPS(10mmol/L)        1.6μL

上游引物(20μmol/L)    0.5μL

下游引物(20μmol/L)    0.5μL

Taq E(2.5U/μL)        0.2μL

模板DNA                1.0μL

补足ddH₂O至            20μL

PCR扩增参数：94℃    3min

30个循环

72℃    10min。

附图说明

图1为应用嗜酸乳杆菌特异引物对嗜酸乳杆菌标准菌株及乳杆菌属其它菌株进行PCR的实验结果。其中，各泳道的具体说明如下：

泳道1：DNA分子量标准：100bp标准分子量

泳道2：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus CGMCC 1.1878^T)

泳道3：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus CGMCC1.2686)

泳道4：嗜酸乳杆菌(L.acidophilus CGMCC1.1854)